实验目的 致病性大肠杆菌是引起新生儿脑膜炎的主要病原体。在致病机理中，大肠杆菌穿过血脑屏障的主要组成部分——人脑微血管内皮细胞是很关键的环节。然而，这一过程的机制尚不清楚。阐明大肠杆菌穿过血脑屏障的机制，不仅能为防治新生儿脑膜炎提供新策略，而且也可望为原核生物与真核细胞相互作用的分子基础研究提供科学资料。 大肠杆菌穿过血脑屏障是多因素参与的过程，PI-3激酶(PI3K)是参与大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞的重要信息分子。本研究室以前的研究发现，PI3K→Akt／Rock→LIMK→Cofilin信号通路在大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞中起重要作用。但是介导大肠杆菌侵袭HBMEC的FI-3激酶的上游信号通路尚不清楚。 本研究旨在寻找介导E．coli K1侵袭HBMEC的PI-3激酶的上游信号分子及其可能的信号转导通路，以期为阻止E．coli K1进入脑内提供新的干预靶点。 实验材料与方法 实验材料 1．人脑微血管内皮细胞 2．致脑膜炎大肠杆菌D44菌株 3．细菌侵袭实验相关试剂 4．细胞骨架荧光染色相关试剂 5．Western印迹相关试剂 实验方法 二．人脑微血管内皮细胞培养与Src家族蛋白酪氨酸激酶特异的选择性抑制剂PPI和PPZ处理。 2．应用致脑膜炎大肠杆菌E44菌株进行人脑微血管内皮细胞侵袭实验。 3．采用罗丹明一毒伞素荧光染色技术观察E44菌株对人脑微血管内皮细胞的侵袭。 4．Western印迹检测人脑微血管内皮细胞中相关信号蛋白磷酸化水平的变化。 结 果 1．E COlt侵袭实验结果： 经Src家族蛋白酪氨酸激酶特异的选择性抑制剂PPI和Pp门一50umol／L）处理的人脑微血管内皮细胞，E44菌株的侵袭明显降低。而且w 和PPZ对E44菌株侵袭人脑微血管内皮细胞的抑制效应为剂量依赖式的。 2．细胞骨架荧光染色结果： E44侵袭人脑微血管内皮细胞可以引起肌动蛋白微丝聚集，肌动蛋白吞噬杯形成等肌动蛋白细胞骨架重排的动力学改变，而IN4感染的经＊p0 umol／L）预处理过30min的人脑微血管内皮细胞中，不能观察到这些典型的细胞骨架改变。 3．Western印迹结果： IN4侵袭可以引起人脑微血管内皮细胞Akt的磷酸化，且Akt磷酸化的时间门口一15ndn达高峰）与肌动蛋白微丝聚集的时间相一致，而E44感染的经PPIK0 tunoUL）预处理过30min的人脑微血管内皮细胞，Akt磷酸化水平变化不明显。 ·2· 讨 论 本研究的侵袭实验结果表明Src家族激酶特异的选择性抑制剂PPI和PPZ可以抑制E44对人脑微血管内皮细胞的侵袭，提示Src家族激酶的催化活性与E44侵袭人脑微血管内皮细胞有关。经呷 预处理的人脑微血管内皮细胞，E44感染后的细胞骨架荧光染色结果不再表现被大肠杆菌侵袭的典型变化，进一步证实Src家族激酶参与了E44对人脑微血管内皮细胞的侵袭。Weste。印迹结果表明PPI可以抑制E44感染人脑微血管内皮细胞所引起的 Akt磷酸化，提示 Src家族激酶可能是 PI3 K／Akt的上游信号分子。 Src家族激酶与PI－3激酶在信号转导通路中的作用因不同种细胞或处于不同状态下的同种细胞而异。本研究中我们首次发现在D以感染的人脑微血管内皮细胞中 Src家族激酶对 PI3 K／Akt的激活，并通过下游信号分子引起细胞骨架的重排，实现E44对人脑微血管内皮细胞的侵袭。 结 论 二．Src家族激酶参与了h：44对人脑微血管内皮细胞的侵袭过程。 2．在介导E44侵袭人脑微血管内皮细胞的信号转导通路中，Src家族激酶可能是 PI3 K／Akt的上游信号分子。