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圆柚酮是一种高价值的倍半萜烯,有着独特的愉悦气味,在食品和化妆品行业极受欢迎。圆柚酮主要生产原料是葡萄柚果皮,但其含量极低,导致其产量低而无法满足广阔的市场需求。虽然化学全合成圆柚酮在科学上取得成功,但由于该方法采用致癌物、重金属、易燃物和强氧化物等,导致生产的圆柚酮成本高且不被市场认可。因此,采用合成生物学技术可能会成为生产圆柚酮的一种更为有效的方法。圆柚酮生物合成前体和其它倍半萜烯一样,都为法尼烯焦磷酸（farnesyl diphosphate,FPP）,在植物中普遍存在。从FPP到圆柚酮共涉及到两个酶促反应:首先瓦伦西合成酶（valencene synthase,VS）催化FPP环化为瓦伦烯,随后瓦伦西氧化酶（valencene oxidase,VO）催化瓦伦烯转化为圆柚酮。圆柚酮生物合成基因的鉴定,为采用合成生物学技术生产圆柚酮提供了必不可少的元件。目前,在毕赤酵母中重建圆柚酮合成途径已经取得成功。同理,采用合成生物学技术在植物中重建圆柚酮生物合成途径也应当可行。药用植物青蒿含有丰富的倍半萜类化合物,如青蒿素（artemisinin）、法尼烯和石竹烯等以及这些倍半萜的前体物质FPP。青蒿中富含FPP使得其可以作为生产圆柚酮的理想底盘植物;培育产圆柚酮的青蒿还有助于提高青蒿的综合经济价值。本研究设计了两种合成生物学方案在青蒿中重建圆柚酮生物合成途径:方案一是通过将VS和VO引入青蒿胞质而重建圆柚酮生物合成途径;方案二是通过质体转运肽将法尼烯合成酶（farnesyl diphosphate synthase,FPS）、VS和VO引入青蒿质体中而重建圆柚酮生物合成途径。通过相关研究,取得了以下结果:1.植物表达载体的构建通过引入pBI121中的35S启动子和植物表达载体p EG104中的OCS终止子,在植物双元表达载体p1305.1中构建新的表达框,引入35S启动子所用的限制性内切酶是Hind III和Pst1,引入OCS终止子所用限制性内切酶为Bam H1和Eco R1,并将改造的载体命名为p ZZG100,该载体可用于插入相关生物合成基因。结合已经报道的阿拉斯加黄柏心材中VO编码区基因序列（Gen Bank Accession:JX518290.1）和VS编码区基因序列（Gen Bank Accession:JX040471.1）,通过PCR扩增获得VO和VS的编码区基因序列。在胞质中共表达VO和VS植物表达载体的构建。在植物双元表达载体pZZG100中35S启动子和OCS终止子之间的表达框引入VS基因片段,所用限制性内切酶为Sal1和Bam H1,并将其命名为p ZZG100-VS;在重组质粒载体p ZZG100-VS中35S启动子和NOS终止子之间的表达框引入VO基因片段,所用限制性内切酶为Sac1和Kpn1,并将其命名为p ZZG100-VS+VO,该重组植物表达载体用于在青蒿胞质中重建圆柚酮的合成途径。通过质体转运肽（transit peptide,TP）的协助,在质体中共表达FPS、VO和VS植物表达载体的构建。在植物表达载体p ZZG100-VS+VO中的VO基因片段处同源重组TP基因片段,所用限制性内切酶为Sac1,将其命名为p ZZG100-VS+tp VO;在重组载体质粒p ZZG100-VS+tp VO中的VS基因片段处同源重组tp FPS融合基因片段,所用限制性内切酶为Sal1,并将其命名为p ZZG100-tp FPSVS+tp VO,该重组植物表达载体用于在青蒿质体中重建圆柚酮的合成途径。2.转基因青蒿的获得和分子检测通过植物表达载体pZZG100-VS+VO将VS和VO引入青蒿胞质而重建圆柚酮生物合成途径的转基因青蒿的获得和分子检测:在农杆菌EHA105的介导下,采取叶盘侵染的方法获得转基因青蒿。获得抗性筛选阳性转基因青蒿后,提取青蒿DNA,通过PCR扩增检测目的基因VO、VS和潮霉素抗性基因（hygromycin resistance gene,Hygr）,在转基因青蒿C1、C2、C3、C8、C13共5个株系中同时检测到VO、VS和Hygr;获得转基因青蒿后,提取转基因青蒿和同期野生型青蒿的RNA,反转为c DNA后,采取q PCR的技术对转基因青蒿中目的基因表达量进行分析,转基因青蒿C1、C2、C3、C8、C13中目的基因VO和VS都有表达,同期野生型青蒿中未检测到VO和VS的表达。通过植物表达载体pZZG100-tp FPSVS+tp VO将FPS、VO和VS引入青蒿质体中而重建圆柚酮生物合成途径的转基因青蒿的获得和分子检测:获得抗性筛选阳性转基因青蒿后,检测转基因青蒿中的目的基因tp FPS、VO、VS和Hygr,在转基因青蒿P5、P6、P9、P10、P11共5个株系中同时检测到tp FPS、VO、VS和Hygr;获得转基因青蒿后,采取q PCR技术对转基因青蒿中目的基因表达量进行分析,转基因青蒿P5、P6、P9、P10、P11中目的基因VO和VS都有表达,同期野生型青蒿中未检测到VO和VS的表达。利用GC-MS检测在青蒿胞质中重建圆柚酮生物合成途径的转基因青蒿和同期野生型青蒿中圆柚酮的含量。野生型青蒿中没有检测到圆柚酮,转基因青蒿中都检测到不同含量的圆柚酮,对结果进行统计分析,转基因青蒿C1中圆柚酮含量为7.65×10-3 mg·g-1（FW）、C2中圆柚酮含量为5.01×10-3 mg·g-1（FW）、C3中圆柚酮含量为8.51×10-3 mg·g-1（FW）、C8中圆柚酮含量为3.64×10-3 mg·g-1（FW）、C13中圆柚酮含量为0.88×10-3 mg·g-1（FW）。利用GC-MS检测在青蒿质体中重建圆柚酮生物合成途径的转基因青蒿和同期野生型青蒿中圆柚酮的含量。野生型青蒿中没有检测到圆柚酮,转基因青蒿中都检测到不同含量的圆柚酮,对结果进行统计分析,转基因青蒿P5中圆柚酮含量为21.45×10-3 mg·g-1（FW）、P6中圆柚酮含量为47.80×10-3 mg·g-1（FW）、P9中圆柚酮含量为12.92×10-3 mg·g-1（FW）、P10中圆柚酮含量为12.11×10-3 mg·g-1（FW）、P11中圆柚酮含量为19.50×10-3 mg·g-1（FW）。这些结果表明,质体中圆柚酮生物合成的工程设计优于细胞质。有趣的是,发现CYP酶VO即使在质体中也起作用。4.转基因青蒿中青蒿素和二氢青蒿酸含量测定利用HPLC检测在青蒿胞质中重建圆柚酮生物合成途径的转基因青蒿和同期野生型青蒿中青蒿素和二氢青蒿酸含量。对结果进行统计分析,同期对照组的野生型青蒿中青蒿素含量为14.05 mg·g-1（DW）,转基因青蒿C1、C2、C3、C8、C13中青蒿素含量分别为12.22 mg·g-1（DW）、15.23 mg·g-1（DW）、10.91 mg·g-1（DW）、13.66 mg·g-1（DW）、12.56 mg·g-1（DW）;同期对照组的野生型青蒿中二氢青蒿酸含量为1.60 mg·g-1（DW）,转基因青蒿C1、C2、C3、C8、C13中二氢青蒿酸含量分别为1.14 mg·g-1（DW）、1.50 mg·g-1（DW）、0.83 mg·g-1（DW）、1.20 mg·g-1（DW）、1.67 mg·g-1（DW）,统计分析显示青蒿素和二氢青蒿酸的生产没有改变。利用HPLC检测在青蒿质体中重建圆柚酮生物合成途径的转基因青蒿和野生型青蒿中青蒿素和二氢青蒿酸含量。对结果进行统计分析,同期对照组的野生型青蒿中青蒿素的含量为14.05 mg·g-1（DW）,转基因青蒿P5、P6、P9、P10、P11中青蒿素含量分别为13.33 mg·g-1（DW）、14.73 mg·g-1（DW）、11.77 mg·g-1（DW）、16.24 mg·g-1（DW）、13.27 mg·g-1（DW）;同期对照组的野生型青蒿中二氢青蒿酸含量为1.60 mg·g-1（DW）,转基因青蒿P5、P6、P9、P10、P11中二氢青蒿酸含量分别为0.99 mg·g-1（DW）、1.55 mg·g-1（DW）、1.17 mg·g-1（DW）、1.01 mg·g-1（DW）、1.19 mg·g-1（DW）,统计分析显示青蒿素和二氢青蒿酸的生产没有改变。综上所述,本研究通过两种合成生物学方案成功在青蒿胞质和质体中重建了圆柚酮生物合成途径,首次在不生产圆柚酮的植物中合成了圆柚酮,开发了一种生产圆柚酮的新方法,并且质体工程中圆柚酮生产量显著高于胞质工程中圆柚酮的3.转基因青蒿中圆柚酮含量测定生产量;同时青蒿素和二氢青蒿酸的生产量没有改变,这种生产圆柚酮的青蒿是具有巨大市场潜力的增值材料。