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长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)已经被证明在植物的生长发育过程中发挥重要作用。lnc RNA可以作为信号分子、诱饵分子、骨架分子等角色,在转录、转录后、翻译等各水平调控其它基因的表达。作为miRNA的内源伪靶基因(endogenous target mimicry,eTM)与靶基因进行竞争以有效地抑制相应miRNA的活性是某些lnc RNA的主要功能。本实验室前期利用白菜‘矮脚黄’核不育两用系‘Bcajh97-01A/B’为材料,进行了花粉发育过程表达的lnc RNA和miRNA高通量测序,发现miR160及其两个潜在的伪靶基因(分别命名为braeTM160-1和bra-eTM160-2)均在白菜花粉发育过程表达。其中bra-eTM160-1与拟南芥中已知功能的miR160的eTM(ath-eTM160-1)同源,而bra-eTM160-2是白菜等具有AA基因组的芸薹属物种中特异存在的。本论文对这两个lnc RNA是否参与花粉发育,及其是否调节miR160的表达进行了分析。首先通过RACE技术(rapid-amplification of c DNA ends)获得了braeTM160-1和bra-eTM160-2的全长序列,随后在菜心中进行过表达探究了它们在花粉发育中的作用,最后检测了转基因植株中miR160及其靶基因ARF家族三个成员的表达变化。取得如下主要结果:(1)利用qRT-PCR对bra-eTM160-1和bra-eTM160-2在根、茎、叶、花序、角果等不同组织,不同发育时期的花蕾,以及授粉后不同时间的雌蕊组织中的表达情况进行检测,发现两者在不同组织中具有遍在表达的特点,但bra-eTM160-1在根和茎中的表达量最高,而bra-eTM160-2在花序中优势表达,两者在不同发育时期花蕾及授粉后不同时间的雌蕊中的表达也存在差异,bra-eTM160-1在‘Bcajh97-01A/B’可育株系(B系)及不育株系(A系)花蕾和雌蕊不同发育时期的表达量无明显差异,但bra-eTM160-2在可育株系的5级花蕾和不育株系的4级花蕾中表达量明显高于其它时期。(2)qRT-PCR检测显示miR160在‘Bcajh97-01A/B’花蕾发育不同时期的表达水平差异不大,但是在授粉受精后的各个时期,miR160的表达量明显上升,尤其是在授粉受精后3 h的雌蕊中,表达量达到最高。(3)对白菜基因组中miR160的5个靶基因Br ARF10、Br ARF16-1、Br ARF16-2、Br ARF17-1和Br ARF17-2在‘Bcajh97-01A/B’A系和B系中的表达情况分别进行了qRT-PCR分析,发现5个基因在A系和B系不同组织中的表达情况无明显差异。在花蕾发育不同时期,Br ARF10的表达主要集中在后期;Br ARF16-1在各个时期的表达无明显差异,在授粉受精后明显上调;Br ARF16-2也是在发育的后期表达较高;相比之下,Br ARF17-1和Br ARF17-2在花蕾发育的早期就有较高水平的表达。(4)通过RACE技术获得了bra-eTM160-1和bra-eTM160-2的全长序列,其中bra-eTM160-1全长415 nt,bra-eTM160-2全长348 nt,两者均无内含子。通过氨基酸序列分析和编码潜能分析,明确发现两者均符合lnc RNA的序列特征。(5)构建bra-eTM160-1和bra-eTM160-2的过量表达载体,获得4个过量表达bra-eTM160-1的菜心芽系,3个过量表达bra-eTM160-2的菜心芽系,发现过量表达bra-eTM160-1的菜心植株中仅一个芽系OE-15花粉发育异常,其它芽系与野生型菜心无差异。而过表达bra-eTM160-2的所有菜心芽系均出现花粉部分畸形,且畸形花粉无活力;扫描电镜结果统计发现畸形比例为47%-68%;利用透射电镜观察花粉发育过程以探究花粉畸形的原因,发现过表达bra-eTM160-2转基因植株在单核花粉早期开始出现细胞质降解,单核花粉后期萌发沟处内壁发育异常,不能均匀加厚,且花粉粒自萌发沟处向内凹陷,双核花粉时期花粉皱缩程度加剧,后期细胞质完全降解,成为空泡状,导致花粉完全坍塌;对成熟花粉的花粉内壁进行卡尔科弗卢尔荧光增白剂染色,发现发育异常的花粉无染色信号;花粉体外萌发实验则发现畸形花粉不能正常萌发。过量表达bra-eTM160-1菜心OE-15芽系的花粉发育异常表型与过量表达bra-eTM160-2的菜心芽系一致。(6)通过qRT-PCR分别检测bra-eTM160-1和bra-eTM160-2过表达转基因植株中miR160及靶基因ARF的表达量,结果发现bra-eTM160-1过表达转基因OE-15芽系中miR160显著下调,Br ARF10、Br ARF16-1、Br ARF16-2、Br ARF17-1、Br ARF17-2均有不同程度的表达上调,其中Br ARF17-1和Br ARF17-2上调量最为明显;bra-eTM160-2过表达转基因植株体内miR160显著下调,Br ARF10、Br ARF16-1、Br ARF16-2、Br ARF17-1、Br ARF17-2均有不同程度的表达上调。