目的：心房颤动(Atrial fibrillation, AF)简称房颤,是临床上最常见的持续性心律失常之一,具有较高发病率和死亡率,发病率随年龄增长而增加。调查研究显示一般人群AF患病率为1%-2%,且AF患者脑卒中发生率增加5倍,严重影响人群生存质量。目前AF发生的电生理和分子病理机制复杂,尚未完全阐明。心房肌细胞胞内钙调控异常及心房肌细胞跨膜离子流的改变而引起的心房电重塑在AF的发生和维持中起重要作用。小电导钙激活钾通道(small conductance Ca2+-activated K+channels, SK)的其中一种亚型SK2主要在心房肌中分布。SK2通道在人与鼠的心房肌和心室肌表达存在差异,在心房肌表达更为丰富。SK2通道对细胞内游离钙离子[Ca2+]i高度敏感,能够将[Ca2+]i的变化快速转换成细胞膜电位变化,是近年来AF机制研究的热点离子通道之一。已证实,AF时心房肌细胞出现钙紊乱,发生胞内钙超载；另一方面,SK2通道钙离子敏感性增加。因此我们推测心房肌细胞胞内钙超载及SK2通道钙离子敏感性的变化可能影响SK2通道功能,SK2通道功能改变参与AF的发生和维持,深入探讨这些问题对阐明AF发生的病理生理机制具有重要意义。此外,蛋白激酶A(Protein kinase A, PKA)参与了AF时胞内钙紊乱的病理过程,且对SK2通道的调节作用在表达细胞和神经系统得到充分证明,但其对心房肌细胞SK2通道的调控作用尚未见报道。本实验主要应用膜片钳技术观测AF患者心房肌细胞SK2通道功能的改变及PKA相关途径对SK2通道电流的调节,旨在从细胞水平探讨PKA通过影响SK2通道功能参与AF电重构过程。方法：(一)电生理实验将30例(细胞n=32)接受体外循环手术患者标本分为两组：房颤组(AF)10例(细胞n=11),窦性组(SR)20例(细胞n=21)。人心房肌细胞的获得：获取体外循环术中切除的右心耳组织,在氧饱和Cardiplegic液中清洗并将组织剪成约1mm3的小块,采用本实验室改良的急性酶分离方法进行两步酶消化：酶Ⅰ液(XXIV蛋白酶12.2U/ml,V胶原酶150U/ml,BSAl mg/ml),酶Ⅱ液(V胶原酶150U/ml,BSA1mg/ml),现配现用。人心房肌细胞SK2通道电流的记录：将急性酶分离的人心房肌细胞置于全细胞浴液中,选择贴壁良好、折光性强、表面光滑的单个心房肌细胞作为研究对象,采用膜片钳全细胞记录模式进行SK2通道的电流记录。所得电流通过膜片钳放大器(EPC10)放大,滤波(2kHz)后输入计算机,经PatchMaster采集软件采集数据,Clampfit10.1、OriginPro8.0软件进行分析作图。以人心房肌细胞为研究对象进行实验,实验内容：(1)人心房肌细胞SK2通道电流基本特性研究。(2)在全细胞膜片钳模式下对比SR组和AF组SK2通道电流密度及其在混合电流中所占比例的差异。(3)在全细胞膜片钳模式下观察PKA特异性抑制剂H-89对SK2通道电流的调节作用。(二)蛋白质水平测定实验SR组和AF组心房肌组织标本分别11例和13例,采用BCA法及ELISA法检测SR组和AF组心房肌组织总蛋白及PKA水平。结果：(1)人心房肌细胞SK2通道特性①在全细胞膜片钳模式下,给予SK2通道电流记录的刺激方案,可记录到混合电流,在浴液中加入SK2通道的特异性阻断剂apamin(10-7mol/L),加药前后的混合电流相减即可获得SK2通道电流。②在全细胞膜片钳模式下,10-7mol/L的apamin能够抑制部分内向整流混合电流,将apamm洗脱后,能够基本恢复被抑制的电流。分析后结果显示,本实验记录到的心房肌细胞SK2通道电流具有内向整流特性,且能被apamin特异性阻断。(2)与SR组相比,AF组SK2通道电流的改变电极液中钙离子浓度为5×10-7mol/L时,在全细胞膜片钳模式下记录的AF组SK2通道电流明显大于SR组。在-130mV钳制电压下,SR组和AF组SK2通道电流密度分别为-2.61±0.14pA/pF、-6.21±0.59pA/pF(nSR=15,nAF=6,P<0.05)；SK2通道电流在混合电流中所占比例分别为20.011±1.44%、42.87±1.79%(nSR=15,nAF=6,p<0.05)。(3)H-89对SR组和AF组SK2通道电流的调控10μmol/L H-89能够降低SR组和AF组SK2通道电流密度,且对AF组SK2通道电流密度抑制更明显。在-130mV钳制电压下,H-89对SR组和AF组SK2通道电流密度抑制比分别为39.27±4.08%、76.32±2.94%(nSR=6,nAF=5,p<0.05)；H-89使SR组和AF组SK2通道电流在混合电流中比例下降,抑制比分别为37.48±4.77%、56.40±3.66%(nSR=6,nAF=5,p<0.05)。(4)PKA含量变化SR组和AF组PKA含量分别为511.91±7.22pg/mL.444.09±7.88pg/mL(nsR=11,nAF=13,p<0.05)。结论：(1)人心房肌细胞SK2通道具有内向整流特性,且能被apamin特异性阻断。(2)电极液内游离钙离子浓度为5×10-7mol/L时,AF组的SK2通道电流密度及其在混合电流中比例大于SR组,提示SK2通道电流改变,是AF发生和维持的基础之一,参与了心房电重构过程。(3)PKA能够通过一定途径调节SK2功能,抑制PKA可使SK2通道电流密度下降,且对AF患者心房肌细胞SK2通道的调节更为显著。(4)AF患者心房肌组织PKA含量降低,参与AF心房肌离子通道调节及心房电重构。