AGEs诱导的血管内皮细胞损伤和Mn-SOD-ADSCs对损伤内皮细胞的修复作用及其线粒体机制

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目的:研究晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)对血管内皮细胞线粒体功能的影响,损伤内皮细胞与Mn-SOD修饰的脂肪干细胞(Mn-SOD-ADSCs)共培养后的修复情况,探索AGEs对血管内皮细胞损伤的线粒体相关机制和Mn-SOD-ADSCs对内皮细胞的救助效果及可能的机制,为脂肪干细胞移植手段应用于糖尿病并发症的治疗提供新的理论基础和实验依据。  方法:以不同浓度(50,100μg/mL)的AGE-BSA处理细胞株人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells,HAECs)48 h,CCK-8法测定HAECs细胞的增殖活性,TBA法和黄嘌呤氧化酶法分别测定细胞MDA含量及SOD活力,DCFH-DA探针检测细胞内活性氧(ROS)的水平,分析AGEs对细胞氧化还原水平的影响;JC-1法检测细胞线粒体膜电位(MMP),荧光素-荧光素酶法和Clark氧电极法分别测定细胞中ATP的含量和细胞的耗氧率,MitoTracker Red染色法检测线粒体数量,分析线粒体功能的变化;Western blot检测心磷脂酰基转移酶(ALCAT1)及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达水平。为了验证细胞株实验结果的可靠性,应用植环法分离培养大鼠主动脉内皮细胞(rat aorticendothelial cells,RAECs),再用荧光免疫法对其进行鉴定,CCK-8法测定AGE-BSA(50μg/mL)对RAECs细胞增殖活性的影响,并检测一系列与细胞株实验相同的指标,包括氧化应激指标、线粒体功能相关指标以及相关蛋白表达水平的检测。分离培养rADSCs,使用pAV-MCMV-SOD2-3Flag-IRES2-EGFP重组腺病毒载体转染rADSCs,使rADSCs过表达线粒体特有的超氧化物歧化酶SOD2(即Mn-SOD);Mn-SOD-rADSCs再与内皮细胞共培养,测定线粒体相关的指标,包括使用MitoSOX Red染色检测线粒体来源的ROS水平、荧光素-荧光素酶法和Clark氧电极法分别测定细胞中ATP的含量和细胞的耗氧率;MitoTracker Red染色法观察过表达SOD2(即Mn-SOD)与线粒体共定位情况,活细胞工作站记录共培养细胞之间的TNT样结构及物质转运情况。  结果:在第一部分研究中,发现AGE-BSA作用可以引起HAECs氧化应激损伤,通过CCK-8法检测及倒置相差显微镜观察,AGE-BSA浓度依赖性地抑制HAECs细胞的增殖,AGE-BSA能够提高细胞氧化水平,包括细胞MDA含量的增加、SOD活力的下降以及细胞内ROS水平的升高;AGE-BSA能够诱导HAECs线粒体功能发生紊乱:线粒体膜电位(MMP)下降、ATP产生明显减少、细胞耗氧能力的下降,同时AGE-BSA还能够引起线粒体断裂的增多;另外AGE-BSA可以上调ALCAT1的表达;AGE-BSA还能够引起细胞发生凋亡:Bcl-2表达量下降、Bax表达量明显上升以及Caspase-3表达水平下降。第二部分首先成功培养出RAECs,3-4天细胞从血管环爬出,8-9天细胞融合成单层,镜下呈铺路石状排列,经Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色后,发现绝大部分细胞核周围出现红色荧光阳性反应,确定所培养细胞属于内皮细胞;AGE-BSA作用后同样能够引起RAECs氧化应激损伤、线粒体功能发生紊乱,并出现凋亡,与第一部分结果相一致。第三部分,使用pAV-MCMV-SOD2-3Flag-IRES2-EGFP重组腺病毒载体成功转染rADSCs,倒置荧光显微镜观察结果显示细胞绝大部分显示绿色荧光,转染率达95%以上;与Mn-SOD-ADSCs共培养后,与对照组相比,损伤内皮细胞中线粒体来源的ROS水平下降、细胞内ATP含量及细胞耗氧率均有所升高,说明共培养可以使得损伤内皮细胞线粒体功能得到修复;MitoTracker Red染色,倒置荧光显微镜观察到Mn-SOD-ADSCs中过表达的SOD2(即Mn-SOD)与线粒体基本共定位,活细胞工作站观测结果显示共培养时,Mn-SOD-ADSCs与损伤RAECs之间存在TNTs样结构,并发现有线粒体的转运。  结论:AGE-BSA能够使内皮细胞发生氧化应激损伤和线粒体功能紊乱,引发细胞凋亡;与Mn-SOD-rADSCs共培养能够改善损伤内皮细胞中线粒体的功能,其可能机制之一是通过两种细胞间的TNTs样结构转运过表达Mn-SOD的线粒体起到了救助作用。总之,AGE-BSA损伤内皮细胞过程中线粒体起着重要作用,TNTs可能是干细胞治疗的新机制,为ADSCs移植应用于糖尿病并发症治疗的研究提供了新的理论基础和实验依据。
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