1研究目的与意义乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,20世纪以来乳腺癌的发病率在世界各地均有上升的趋势，在欧洲、北美占女性恶性肿瘤发病的第一、二位。中国在九十年代初有乳腺癌患者20万，每年新发病约5万例。三阴性乳腺癌（triple negativebreast cancer，TNBC）即雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、人表皮生长因子受体2（human epidermal growthfactor receptor2，HER2）均表达为阴性，此型占所有乳腺癌患者的大约20%-25%，恶性程度高、侵袭性强，目前没有标准治疗方案，虽对化疗敏感，但易复发和转移，也易产生耐药性，5年生存率不足15%。癌细胞来源于正常细胞，与正常细胞的差别很小，但有些蛋白是是癌细胞所特有的，而正常细胞缺乏或表达低而不易找到。本实验研究的MCSP（melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan，人黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖），又称CSPG4（chondroitin sulfate proteoglycan4，硫酸软骨素蛋白聚糖4)或HMW-MAA（high molecular weight-melanoma associated antigen，高分子量黑色素瘤相关抗原）是人黑色素瘤细胞表面表达的黑色素瘤相关抗原，在正常组织细胞表达很少或缺乏，而在80%以上的黑色素瘤表达；MCSP在进化上很保守，由N端连结的280KD的糖蛋白和450KD的硫酸软骨素蛋白多糖组成，具有较强的免疫原性，早已成为恶性黑色素瘤免疫治疗的重要靶位。新近研究表明：MCSP在一些人乳腺癌特别是三阴性乳腺癌（TNBC）细胞表面表达，是一种潜在的TNBC标志物和“靶位”；MCSP特异性抗体在小鼠实验中显示出良好的抗三阴性乳腺癌转移和复发作用，然而MCSP在人乳腺癌中相关研究报道很少，据文献检索，国内目前未见MCSP特异性抗体的研究报道。本项目以纯化的MCSP为免疫原，采用传统的小鼠杂交瘤技术，建立抗原包被的ELISA法和Cell-ELISA法，以此方法筛选与MCSP和MCSP表达阳性的人黑色素瘤细胞特异性结合的小鼠单克隆抗体；采用辛酸-硫酸铵沉淀法、ProteinG柱层析法分离纯化MCSP特异性的小鼠腹水抗体；采用秋水仙素阻断法、SDS-PAGE等对抗体进行理化等特性鉴定；采用抗原抑制试验、流式细胞技术、免疫荧光染色法对抗体的免疫学结合特性进行鉴定；采用RT-PCR法检测MCSP在人乳腺癌细胞株中表达，并采用流式细胞技术初步研究了MCSP特异性抗体与人乳腺癌细胞株的结合情况。本论文课题研究主要目的为MCSP在乳腺癌中表达、生物学功能研究以及为以MCSP为靶点的抗乳腺癌靶向治疗研究提供抗体工具。2研究的主要内容、方法和结果（1）MCSP免疫原的鉴定：纯化的MCSP由Robert C. Spiro博士提供，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测，证明了此样品具有很好的纯度。用此样品作为免疫原免疫小鼠。（2）MCSP免疫BALB/C小鼠：采用GM-CSF质粒肌肉注射MCSP+与saponin（皂素）混合物的腹腔注射。该免疫方法是成功的：抗原包被ELISA法测定免疫血清效价为1:6400；Cell-ELISA法测定免疫血清效价为1:1600。（3）杂交瘤细胞株筛选方法建立：MCSP抗原包被ELISA法初步筛选出与能分泌MCSP特异性抗体的杂交瘤细胞株；再采用Cell-ELISA（人黑色素瘤细胞株MV3和1520分别为MCSP表达阳性细胞株和阴性细胞株）法筛选能分泌与人黑色素瘤细胞株表面MCSP结合的抗体的杂交瘤细胞。该两种方法均显示：阳性对照抗体mAb225.28结合阳性，阴性对照抗体MK2-23结合阴性，证明筛选方法可行。（4）细胞融合及筛选：细胞融合采用传统小鼠杂交瘤技术。用MCSP免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Ag8.653在PEG介导下融合，经过MCSP包被的ELISA筛选,获得与MCSP结合较强阳性的21孔杂交瘤细胞；采用Cell-ELISA进一步筛选21孔杂交瘤细胞上清抗体，其中P1C6、P2G2、P4E4和P5F5四个孔细胞上清与MV3细胞结合反应阳性，与1520细胞结合反应阴性，其中P4E4孔的上清阳性反应最强，保留这四孔细胞进行克隆；将4E4孔杂交瘤细胞扩大，用有限稀释法进行克隆化处理，采用Cell-ELISA法检测克隆孔细胞上清抗体，细胞克隆阳性率可为100%；取与黑色素瘤细胞MV3结合阳性反应最强的孔P1D2细胞，其产生的抗体命名为CSPG4-0711。将此孔细胞扩大培养，冻存，并用于产生腹水。（5）腹水抗体的制备、纯化：将抗体CSPG4-0711的杂交瘤细胞，注入pristane（降植烷）致敏的BALB/C小鼠腹腔，收集腹水，采用MCSP包被的ELISA法测腹水抗体效价可达1:32000；采用辛酸-硫酸铵沉淀法和亲和层析柱纯化腹水抗体，经Bradford法测定抗体蛋白浓度。收集8ml腹水用辛酸-硫酸铵沉淀法初步纯化获得3ml抗体，浓度为2.6mg/ml；再用ProteinG柱层析法精制纯化获得抗体5.2mg，浓度为1.6mg/ml。（6）杂交瘤细胞鉴定：采用秋水仙素阻断法，在显微镜下计数染色体数，CSPG4-0711的杂交瘤细胞染色体数均数为66条。（7）抗体的理化性质鉴定：纯化的抗体采用常规SDS-PAGE电泳方法（分离胶浓度为10%）鉴定纯度和分子量，经二硫苏糖醇（DTT）还原的纯化抗体，在50KD和25KD处有两条带，证明为Ig；电泳图背景干净、条带清晰，表明纯化抗体纯度较高。（8）抗体的免疫学结合性质鉴定：①抗原抑制试验：将不同浓度MCSP与固定浓度的CSPG4-0711混合，用Cell-ELISA法测定MCSP预先处理是否抑制CSPG4-0711抗体与MV3细胞结合。在浓度范围（5～160μg/ml）内，MCSP呈剂量依赖性地抑制抗体与MCSP表达阳性的MV3细胞的结合，表明抗体与MCSP结合具有特异性。②流式细胞分析法鉴定抗体与细胞表面MCSP结合：CSPG4-0711抗体与MV3细胞结合反应阳性，MFI（平均荧光强度）：45.73～1191.32，且呈抗体剂量（0.5～10μg/ml）依赖性；而与1520细胞结合反应阴性，MFI：7.81～4.58。③免疫荧光染色法鉴定抗体与细胞表面MCSP结合：免疫荧光法显示CSPG4-0711抗体能染色MCSP+的MV3细胞，在细胞表面呈现绿色荧光，而不能染色MCSP-的1520细胞。（9）RT-PCR检测人乳腺癌细胞株中MCSP mRNA的表达：设计MCSP片段引物，采用RT-PCR检测MCSP mRNA在一些人乳腺癌细胞株和人黑色素瘤细胞株中表达情况。在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435s中MCSPmRNA表达呈阳性，而MCF-7、T47D细胞呈阴性，MDA-MB-231、MDA-MB-435s细胞为三阴性乳腺癌细胞；在人黑色素瘤细胞株M21、MV3中为MCSP mRNA表达呈阳性，而1520、M14细胞呈阴性。这与前述ELISA、流式细胞分析、免疫荧光染色结果一致。（10）CSPG4-0711抗体与人三阴性乳腺癌细胞的结合：流式细胞分析法显示：CSPG4-0711抗体可与MBA-MD-231细胞、MBA-MD-435s等人三阴性乳腺癌细胞株结合，不与MCF-7、T47D等非三阴性人乳腺癌细胞株结合，这与RT-PCR结果一致。3通过以上实验，可得以下结论我们采用小鼠杂交瘤技术研制出一组能特异性结合MCSP以及MCSP表达阳性的人黑色素瘤细胞的单克隆抗体，其中CSPG4-0711单抗表现出高亲和力、特异性结合MCSP活性。初步研究显示：CSPG4-0711单抗也能结合人三阴性乳腺癌细胞株，提示该抗体可用于MCSP在三阴性乳腺癌表达、生物学功能以及靶向治疗研究。进一步研究在进行之中。