目的和背景FGF-2又称为碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,FGF-2),是成纤维生长因子家族的一员,最早由Gospodarowicz (1974)从牛脑垂体中提取的一种对BALB／C 3T3细胞等有明显促进生长作用的细胞因子。FGF-2有五种分子量,从18kD到34kD不等。所有的FGF-2异构体都缺乏信号肽,是通过一种现在还不十分清楚的机制分泌到细胞外的,其中18kD FGF-2在体内分布广泛,存在于中胚层及神经外胚层来源的细胞及多种肿瘤细胞中,对这些细胞有促增殖分化功能,参与了胚胎发育、血管生成、损伤修复、神经再生、肿瘤生长、组织纤维化等多项生理及病理过程。FGF-2的生物学效应,除对成纤维细胞和血管内皮细胞具有显著的促增殖作用外,还参与肿瘤发生和发展,特别对肿瘤的浸润和转移具有重要作用。有相当部分的肿瘤(如乳癌、结肠癌、甲状腺癌、肺癌、膀胱癌、食道癌等)存在FGF-2的高表达(表2)。已知其作用环节主要有(1)FGF-2能促进表皮、内皮细胞再生,促进血管内皮细胞分裂,诱导其从基膜中分离出来,以刺激内皮细胞向肿瘤组织趋化运动,并形成管状结构,还提高组织中血纤维蛋白溶解酶原激活因子类及诱导内皮细胞产生其他蛋白酶,从而促进毛细血管的形成；(2)FGF-2能促进多种生长因子的分泌,如VEGF、HGF、FGF-1等,这些因子相互调节,共同促进肿瘤的生长；(3)肿瘤细胞存在FGF-2受体的高表达,通常比正常细胞上FGF-2R高10倍以上,许多肿瘤细胞(如神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、白血病、肺瘤、黑色素瘤、肝癌等)既表达FGF2又表达FGFRs,因此FGF2可直接作用于肿瘤细胞,使肿瘤织的各种蛋白酶及胶原酸分泌增加,从而加速肿瘤细胞的转移过程；(4)FGF-2还与肿瘤的耐药性有关,增强肿瘤对药物诱导的细胞凋亡的抵抗能力[20]。故FGF-2与肿瘤生长、转移、预后有着非常密切的关系。FGF-2与肿瘤肿瘤生长、转移、耐药有关,用抗体阻断FGF-2的活性被认为是一种治疗肿瘤的有效方法。已有多株抗FGF-2抗体体内外抑制肿瘤试验的报道。在多种动物体内,一株中和性的的单抗(GD2)能抑制FGF-2或肿瘤组织诱导的血管新生。在大鼠体内内GD2能抑制骨肉瘤的生长。另一株单抗,3H3,能抑制十二指肠溃疡的血管新生,从而延迟溃疡的愈合,同时它还能抑制一种转染的致瘤性细胞在裸鼠体内的生长。Aonuma等制备了两株中和性单抗,2G11和1E6,前者识别的是FGF-2的肝素结合位点,后者识别的是FGF-2与受体结合的位点,体内实验证实1E6能抑制肿瘤生长,而2G11不具备抗瘤作用。国内,谢庆祥等[7]通过建立裸鼠皮下移植膀胱癌动物模型进行研究,发现FGF-2抗体治疗组皮下瘤体积和重量比对照组均显著减少,瘤组织中增殖细胞核抗原(PCNA)指数和微血管密度(MVD)也显著降低,表明FGF-2抗体对膀胱癌的生长具有明显抑制作用,其主要通过抑制膀胱癌细胞增殖和减少肿瘤血管形成的途径而在荷瘤裸鼠体内发挥抗肿瘤作用。林卫等观察了FGF-2抗体对人卵巢癌细胞的增殖、卵巢癌腹腔移植瘤裸鼠的生存率和人卵巢癌移植瘤血管生成和肿瘤生长的影响。研究结果显示,FGF-2抗体能明显抑制卵巢癌细胞的增殖,卵巢癌的生长和血管生成,并呈浓度依赖性,提示FGF-2单抗有望成为卵巢癌生物治疗的新方法。本实验室前期制备了19株鼠抗FGF-2单抗,通过体外实验证实,其中三株抗体能够诱导B16细胞凋亡,近期的体内试验发现其中一株抗体能够明显抑制黑色素瘤的生长和转移,延长荷瘤小鼠的生存期,同时与化疗药物顺铂、紫杉醇等联合使用能够明显抑制黑色素癌的生长,而对于那些对化疗药物耐药的肿瘤抗FGF-2单抗能逆转其耐药性。这些报道证实在多种试验条件下,抗FGF-2抗体能阻断血管新生和抑制肿瘤生长。但这些抗体都是动物来源的抗体,用于人类疾病的治疗存在半衰期短、血清病发生率高、易在人体内产生抗体导致不能重复使用等弊。制备全人源性的抗FGF-2抗体,是克服上述弊端有效方法。人源性抗体的制备技术主要有三种,第一种是通过表面展示技术从人源性抗体库中筛选人源性抗体,第二种技术是通过免疫转入人免疫球蛋白基因的转基因鼠来获得针对特异抗原的人源性抗体,第三种技术是通过细胞分选技术,从某些病人骨髓细胞或外周血细胞中筛选特异性针对某种抗原的B细胞或记忆性B细胞,通过某些技术如与人骨髓瘤融合或用EB病毒使其永生化,使得这些B细胞能在体外无限繁殖,从而分泌人源性抗体。这三种技术中第二种技术需要购买或构建转基因小鼠,需要耗费大量财力和物力。第三种技术需要特殊病人的血细胞,并且需要获得人源性杂交瘤或刺激B细胞的永生化,这些技术目前还不成熟。表面展示技术具有极强的筛选功能,将序列互不相同的一组多样化的抗体表达到细菌,酵母,病毒表面,得到抗体展示库因此,利用其表型与基因型的统一以及易于扩增的特性,可很容易的从库中筛选出针对某种特异抗原的抗体。其中以噬菌体展示技术应用最为广泛。从噬菌体抗体库中直接筛选获得高亲和力抗体,其主要影响因素是抗体库容量大小和抗体基因的成熟度,其多样性要能保证有这种抗体存,并且在经过扩增后具有被筛选出来所要求的拷贝数,因此增加噬菌体抗体库的库容量尤其重要。根据已有报道,从大于109的大容量天然抗体库中,往往可以得到高亲和力的抗体,无需进行抗体亲和力成熟。本研究所用的抗体库为经过单载体细胞内重组法(Lxop-cre定位重组系统)两次重组配对后的人源性大容量抗体库,重组后库容约为6×1010,沉淀浓缩后滴度约为1013cfu／ml,具有良好的多样性,可以充分满足筛选的需要,在获得高亲和力抗体以及进行抗体性能改造方面具有较强的优势。在抗体的进化过程中,基因突变并不是随机发生于可变区内的,而是倾向性的集中在CDR区的某些位置,即突变热点,有多种类型,其中研究较详细的热点类型有AGY／RGYW和TAY(R=A／G,Y=C／T,W=A／T)。这些位点也常常是位于和抗原直接结合的区域中。针对这类位点引入突变,相较于这类位点之外的区域将更可能得到亲和力提高的基因工程抗体,而且可以通过构建小型的突变库来实现。Ho等研究发现,CDR区的突变热点分为胚系热点和非胚系热点,只有突变胚系热点才能提高抗体的亲和力。因此对抗体胚系热点进行突变将是本文采取的方法。方法1.利用固相筛选技术从大容量噬菌体抗体库(6×1010)中筛选能特异性结FGF-2的克隆,经过三到四轮的洗脱筛选,将得到的阳性克隆通过酶切鉴定,可变区多样性分析,基因测序和序列比对,确定能特异性结合FGF-2的序列正确的阳性克隆。2.将测序正确的阳性克隆的基因插入到原核表达载体pComb3XSS中,在低温培养条件下,利用IPTG诱导scFv基因的可溶性表达,离心后收集菌体,PBS重悬后超声破碎,收集破碎上清,通过SDS-PAGE, Western-blot, ELISA鉴定上清中抗体的特异性,通过竞争ELISA检测者几株scFv能否抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1的结合。3.将能够抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1的结合的44克隆通过重叠延伸PCR构建成全长的人源性抗FGF-2抗体,插入到真核表达载体pIGG中,构建成真和表达载体pIGG-44,利用转染试剂FuGene HD转染HEK293T细胞,进行真核可溶性表达,收集细胞培养上清,通过SDS-PAGE, Western-blot,ELISA鉴定上清中抗体的特异性,通过硫酸铵沉淀和蛋白G纯化抗体,通过夹心ELISA测定抗体的浓度。4.表达的全长的人源性抗体通过体外细胞实验验证抗体的中和FGF-2的活性,通过血管内皮细胞促增值实验,迁移实验和成管实验验证抗体对血管内皮细胞的作用,通过肿瘤细胞增殖抑制试验验证抗体对肿瘤细胞的增值抑制作用,通过Hoechst 33258染色观察抗体作用后肿瘤细胞细胞核的变化情况,来观察细胞是否发上了凋亡5.对具有中和活性的44号克隆进行亲和力成熟,利用基因比对从Genebank中搜索出与44号克隆序列最接近的抗体胚系基因序列,然后通过IMTG中的抗体可变区基因在线分析工具V-QUEST,找出重链胚系基因中CDR区的突变热点,并与44号克隆进行比较,确定这些热点在44号克隆重链CDR区中的位置,随后我们通过定点突变对重链可变区CDR1区中的三个胚系热点进行定点随机突变,构建噬菌体抗体突变库,通过三轮洗脱筛选,每轮逐渐增加洗脱次数和减少包被的FGF-2的量来得到亲和力提高的抗体突变株,将高亲和力突变株进行可溶性表达后,通过异硫氰酸铵洗脱法测定抗体的相对亲和力。计算抗体亲和力提高倍数。同时通过竞争ELISA法检测突变株是否还能抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1的结合。结果1.经过3到4轮筛选从104个随机挑选的克隆中,筛得39株抗FGF-2的抗体,通过对抗体可变区基因多样性分析,发现有8种不同抗体可变区基因型,挑选其中8株phage ELISA显色最高的克隆进行DNA酶切和测序鉴定,发现其中7株为正确的抗体基因序列,通过大肠杆菌HB2151成功的进行了scFv的可溶性表达,通过竞争ELISA发现其中三株scFv能够抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1βⅢC的结合,其中44号克隆的抑制效果最好。2.通过对转染试剂,转染方法,培养温度,转染试剂与细胞的孵育时间,组蛋白抑制剂的加入等条件进行优化使人源性抗FGF-2抗体在HEK293T细胞中的表达量从1.5mg／L提高到了15.1mg／L。表达产物经硫酸铵沉淀,透析后上蛋白G亲和层析柱纯化,纯化后的产物经超滤管超滤除盐,最后经SDS-PAGE鉴定,获得纯度为90%的电泳纯抗体,双抗夹心法测定抗体含量,显示产量可以达到每升细胞培养上清12mg抗体。3.通过一系列体外实验证实44号克隆能够抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖,迁移和成管,同时还能抑制神经胶质瘤细胞株U87MG的增殖,Hoechst 33258染色后发现抗FGF-2抗体作用能够诱导U87MG的凋亡4.通过热点随机突变构建44号克隆的单链抗体噬菌体突变库,通过三轮洗脱筛选,筛选到了4株亲和力提高的抗体突变株,经过可溶性表达后,通过异硫氰酸铵洗脱法测定抗体的相对亲和力,显示其中最高的一株亲和力比44号克隆的亲和力提高了4倍。结论1.通过对人源性噬菌体抗体库的筛选得到了七株不同的人源性抗FGF-2抗体,经过体外实验证实其中一株抗体能够中和FGF-2的多种生物学作用,如促血管内皮增殖作用,促细胞迁移作用,内皮细胞成管作用等,更为重要的此株抗体还能诱导神经胶质瘤细胞株U87MG的凋亡。2.通过胚系热点突变使此株中和性抗体的亲和力提高了4倍,与此同时也提高了抗体的中和活性,从而证实了胚系热点突变提高抗体亲和力的可行性。本研究的创新处：1.成功筛选到三株人源性中和性抗FGF-2抗体,其中一株的抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1结合的效果最好,通过细胞实验证实此株抗体能够中和FGF-2的多种生物学作用,为FGF-2抗体药物研究奠定基础。2.成功利用CDR区胚系热点突变提高了一株中和性抗体的亲和力,同时也使得抗体的中和活性增强,证实了此方法可在不改变抗原识别位点的情况下提高抗体的亲和力。