目的随着我国人口老龄化，阿尔茨海默病的人数呈上升趋势，目前大量资料表明，阿尔茨海默病等神经退行性疾病与氧化应激密切相关，氧化应激增加蛋白质氧化损伤和DNA氧化损伤，导致神经元死亡或功能失调、神经退行性疾病发生。而对这些疾病氧化应激机制的研究，已经为临床治疗神经退行性疾病开辟了许多新思路。褪黑素是一种主要由松果体分泌的激素，目前发现它有清除自由基，提高抗氧化酶活性和降低Aβ的神经毒性，调节生物钟及神经免疫等功能。褪黑素具有高脂溶性和低血浆蛋白结合力，很容易通过血脑屏障。因此，已认为它是一种较有前途的治疗AD药物。褪黑素的主要作用：（一）抗自由基作用：(1)直接清除自由基。(2)抑制脂质过氧化反应。(3)增加其它抗氧化酶的活性及基因表达。（二）免疫调节作用；（三）调节内分泌作用。（四）其它作用：褪黑素尚具有调节生物时钟，抑制性激素及生长激素的分泌，调节应激反应，抗衰老等多种生物功能。但其不同浓度时在抗氧化损伤中的具体作用国内外均未见报道。本研究目的是为探讨D-半乳糖和β淀粉样蛋白氧化损伤机制及褪黑素的保护作用。方法课题包括动物模型和体外细胞模型两大部分，在动物研究中采用AD大鼠模型，对模型鼠进行了学习记忆能力检测，实验结果证明模型鼠建立成功，在此基础上应用化学检测法、免疫组织学染色、检测氧化损伤对脑衰老的影响及褪黑素的保护作用，在细<WP=79>胞研究中应用D-半乳糖致衰PC12细胞模型和Aβ25-35诱导分化的PC12细胞损伤模型研究褪黑素抗氧化损伤作用。一、Aβ+D-半乳糖联合模型的建立、行为学变化及褪黑素的改善作用用水迷宫筛选反应迅速、活跃的大鼠随机分为五组，每组12只。，①生理盐水组；②Aβ组；③D-半乳糖组； ④Aβ+D-半乳糖组；⑤褪黑素组， ③ ④组动物腹腔注射D-半乳糖：50mg/kg.d,连续注射6周建立衰老动物模型； ①②组动物腹腔注射等量生理盐水，于第7周②④组大鼠进行双侧海马内注射Aβ，每侧注射1μＬ;①③组注射等量生理盐水。⑤组腹腔注射及双侧海马注射同④组，在海马注射Aβ同时腹腔注射褪黑素5mg/kg.d。模型建立成功后，在一周，两周，四周后用水迷宫实验检测各组大鼠行为学改变，HE染色观察海马区神经元形态；尼氏染色观察尼氏小体；电镜观察海马线粒体超微结构，生物化学方法检测海马及额叶组织SOD活性、MDA含量，免疫组化法检测AD大鼠海马及额叶Bcl-2蛋白质表达，GFAP蛋白的表达。二、利用培养的PC12细胞，MTT法检测细胞活性，观察不同浓度褪黑素、D-半乳糖、Aβ25-35对PC12细胞及分化的PC12细胞活性影响，用流式细胞仪检测Aβ25-35 引起的细胞凋亡及褪黑素对细胞凋亡的影响。结果1、水迷宫测试结果手术后各时间点Aβ组及D-半乳糖组及Aβ+D-半乳糖组与N组比较时间均延长P<0.05，以Aβ+D-半乳糖组为明显P<0.01，而褪黑素干预组延长不明显。2、AD大鼠模型病理形态学变化常规HE染色光镜下观察，生理盐水对照组皮层及海马结构完整，细胞排列整齐，形态正常，分布均匀。Aβ组、D-半乳糖组、<WP=80>Aβ+D-半乳糖组可见海马锥体细胞带紊乱、变稀、中断，同时可见许多细胞体积缩小，胞核固缩，染色加深、皮层也可见散在单个的固缩细胞。而褪黑素干预组变化不明显。电镜下观察海马CA1区及额叶皮质神经元细胞核和细胞器亚结构病理形态学变化，对照组大鼠额叶皮层及海马区神经细胞核呈圆形，核膜双层结构清晰，核内染色质分布均匀，可见核孔、单个或两个核仁。细胞质内细胞器完整、排列有序。线粒体大小及形态正常。内嵴清晰可见，基质均匀，粗面内质网散在分布，表面均匀分布着核蛋白体。高尔基器排列规则分布于核周，树突可见，分布均匀有序密集排列的微管与树突长轴相平行。胶质细胞核圆，核内染色质分布均匀。MT保护组，除神经毡丝数量有所增加外，余同对照组。在Aβ损伤组、D-半乳糖损伤组可见不同程度的神经细胞核固缩，核膜结构不清，核形态不规则，有切迹，核偏位；线粒体肿胀、Aβ+D-半乳糖组可见明显的神经细胞核固缩，线粒体肿胀、可见嵴断裂、空泡形成。染色质浓缩趋边；核基质及胞质基质致密、深染，有者出现空化；同时可见神经元固缩，细胞周围间隙增大；神经毡丝数量增多等改变。3、生化指标检测结果各组大鼠脑海马及额叶生化指标的变化结果表明，各模型组SOD（超氧化物歧化酶）活性下降，MDA（丙二醛）含量增高，以Aβ组+D-半乳糖组变化明显，与盐水对照组比较（P<0 .01），而Aβ组和D-半乳糖组与盐水对照组比较（P<0 .05），而褪黑素干预组有明显改善与Aβ组+D-半乳糖组比较（P<0 .05）。4、免疫组化法检测结果AD大鼠不同脑区Bcl-2变化结果 Bcl-2免疫反应阳性神经元主要表现为核周或胞浆内出现棕黄色的颗粒。在生理盐水对照组额叶及海马部位均可见阳性表达。而Aβ组、D-半乳糖损伤组、Aβ+D-半乳糖组可见海马CA1区损<WP=81>伤后，额叶及海马免疫组化阳性表达神经元与对照组相比明显降低，差异显著。说明各损伤组可致Bcl-2低表达。褪黑素保护组额叶及海马阳性表达神经元与各损伤组相比显著增多，具有统计学意义，而与生理盐水组比较不具有显著