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目的:MEX3A基因是一种新发现的肿瘤相关因子,其与膀胱癌的关系尚未明确。本研究的目的在于通过慢病毒介导的RNA干扰技术,探讨抑制MEX3A基因表达对膀胱癌细胞增殖和凋亡功能的影响。研究方法:1.培养5637和T24两种膀胱癌细胞株,实时定量PCR检测MEX3A基因在两种细胞株中的表达量,选取表达量高者进行后续实验。2.参照基本设计原则,设计、选择合适的RNA干扰序列。3.合成含干扰序列的双链DNA,随后连接酶作用后的慢病毒载体,再将产物转入感受态大肠杆菌细胞,经聚合酶链式反应鉴并测序验证后,进行质粒抽提应用。4.鉴定及测序合格后与包装载体共转染293T细胞产生慢病毒颗粒;病毒滴度测定后转染经步骤一选择的细胞株(5637和T24二选一),实验组转染MEX3A-shRNA慢病毒,对照组转染阴性对照慢病毒,经抗生素筛选建立稳定表达siRNA的细胞株。5.收集实验组和对照组细胞并提取总RNA,反转录后经实时定量PCR检测MEX3A基因敲减效率。6.慢病毒转染三天后,将实验组和对照组细胞分别接种于96孔板连续培养5天,每天使用全视野细胞扫描分析仪进行细胞计数并拍照。7.慢病毒转染五天后,分别收集对照组和实验组细胞,凋亡诱导后用Annexin V-APC进行染色,完成后上流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:1.MEX3A基因在膀胱癌5637和T24细胞中均有表达,且5637的表达量高于T24,选用5637细胞进行后续实验。2.凝胶电泳检测显示阳性克隆PCR片段大小为341bp,空载体克隆PCR片段大小为307bp,与预期值相符;测序结果表明重组的慢病毒载体与设计的靶向链一致,慢病毒载体构建成功。3.逐孔梯度稀释法测定病毒滴度为2×10~9TU/ml,病毒包装成功。4.Real-Time PCR结果显示敲减效率达74%,慢病毒转染5637细胞后能稳定抑制MEX3A基因的表达。5.全视野细胞扫描分析仪细胞计数检测显示,与对照组相比,实验组5637细胞的数量和增殖速率受到显著抑制。6.流式细胞仪检测显示,与对照组相比,实验组发生凋亡的5637细胞显著增加。结论:1.应用慢病毒介导的RNA干扰技术可成功建立稳定抑制MEX3A基因表达的细胞株。2.抑制MEX3A基因表达会减少膀胱癌细胞增殖数量、增加膀胱癌细胞凋亡数量,说明MEX3A基因正向调节膀胱癌细胞的增殖功能,负向调节膀胱癌细胞的凋亡功能。