背景与目的在女性癌症中,乳腺癌(Breast cancer,BCa)的发病率及死亡率位居世界首位。乳腺癌是激素依赖性肿瘤,癌细胞的生长受体内多种激素的调控。根据激素受体不同,乳腺癌被分为四种亚型,包括孕激素受体(PR)阳性、雌激素受体(ER)阳性、人类表皮生长因子受体(HER2)阳性及三阴性乳腺癌。据统计,约70%的乳腺癌患者表现为雌激素受体α(Estrogen Receptorα,ERα)阳性。ERα已经成为治疗乳腺癌最有效的靶点之一。然而,对于目前靶向ERα的内分泌疗法,不少乳腺癌患者产生了耐药。因此,寻求一种新型的抵抗雌激素/雌激素受体信号的治疗方案显得尤为重要。本课题旨在鉴定出以ERα为靶点的小分子化合物,通过调控ERα的转录活性或者ERα蛋白的降解达到抗肿瘤的效果。我们对几种天然产物库进行了大量的筛选,发现紫铆因作为一种传统的中草药,能够有效的抑制ERα蛋白的表达并且影响了ERα阳性(ERα~+)乳腺癌细胞的生长。在本文中,我们主要探讨紫铆因在ERα~+乳腺癌中的作用及机制,并为乳腺癌临床治疗用药提供前期基础。实验方法1.细胞活力的检测:按实验目的处理细胞后,采用MTS法检测细胞活力;2.克隆形成实验:按实验目的处理细胞后,在倒置显微镜下观察细胞集落形成情况,约两周后固定细胞并用结晶紫染色,观察处理对细胞集落形成的影响并计数;3.EdU增殖检测实验:按实验目的处理细胞后,依据Ed U试剂盒说明书进行实验,荧光显微镜下观察Ed U阳性细胞数并拍照;4.流式细胞检测技术:按实验目的处理细胞后,收集细胞并固定,次日染色后用流式细胞检测仪器检测细胞周期进程情况;5.免疫蛋白印迹实验:按实验目的处理细胞后,收集总蛋白,通过免疫蛋白印迹技术观察目的蛋白表达;6.免疫荧光实验:按实验目的处理细胞后,进行免疫荧光实验,观察靶分子的荧光情况及定位;7.分子对接模拟实验:利用Autodock进行分子对接模拟,观察紫铆因与雌激素受体的对接情况;8.双荧光素酶报告基因检测试验:检测紫铆因处理乳腺癌细胞后,对雌激素受体转录活性的影响;9.裸鼠移植瘤模型:购置裸鼠后种植雌激素受体阳性乳腺癌细胞MCF-7,构建裸鼠移植瘤模型,按时给药处理,观察在体移植瘤生长情况。实验结果1.紫铆因介导了雌激素受体阳性乳腺癌细胞的生长抑制在此研究中,我们选择了两株ERα~+乳腺癌细胞系:MCF-7以及T47D,在紫铆因浓度梯度(0,5,10,20)μM/L及时间梯度(24,48,72)小时的处理下使用MTS法检测细胞活力,发现紫铆因抑制乳腺癌细胞生长为浓度依赖及时间依赖。克隆形成实验及Ed U增殖检测实验结果表明紫铆因抑制了MCF-7及T47D的增殖。2.紫铆因阻滞ERα~+乳腺癌细胞细胞周期进程我们使用流式细胞检测技术检测细胞周期,发现紫铆因明显阻滞乳腺癌细胞从G0/G1期到S期的进程。Western blot检测相关周期蛋白,Cyclin D1以及CDK4表达下调,而p27蛋白水平增加。3.紫铆因调控ERα~+乳腺癌细胞ERα的表达MCF-7及T47D给予紫铆因处理后,我们使用Western blot检测ERα的蛋白水平,发现紫铆因下调ERα的蛋白表达但不影响其m RNA水平。免疫荧光实验发现,当紫铆因处理后,细胞核内ERα的荧光强度减低,但并未影响ERα的核转位。4.紫铆因与ERα的结合我们利用Autodock进行分子对接模拟,实验结果表明紫铆因可与ERα直接结合。5.紫铆因促进ERα的降解并抑制其转录活性我们进一步用蛋白合成抑制剂CHX处理乳腺癌细胞,发现在抑制蛋白合成下紫铆因加速了ERα蛋白水平的降解,进一步用20S蛋白酶体抑制剂MG132证明了紫铆因可通过UPS途径降解ERα。双荧光素酶报告基因检测,发现紫铆因抑制ERα的转录活性。6.紫铆因增强了ERα~+乳腺癌细胞对氟维司群的敏感性细胞活力检测实验表明紫铆因联合氟维司群处理ERα+BCa细胞的细胞活力较单一处理时降低。克隆形成实验及Ed U证明了联合处理较单一处理更能抑制细胞增殖能力。流式细胞检测技术发现联合处理愈加阻滞了细胞周期进程。Western blot蛋白检测周期相关蛋白发现联合处理时Cyclin D1蛋白水平较两者单独处理时要低。7.紫铆因抑制了乳腺癌在体移植瘤的生长在雌性裸鼠背部,接种ERα~+乳腺癌细胞,给予腹腔注射10 mg/kg紫铆因,我们发现紫铆因抑制了移植瘤的生长。收获的部分瘤组织所制作的IHC及TUNEL切片结果进一步验证了此结论。结论紫铆因通过促进雌激素受体α泛素化降解抑制乳腺癌细胞生长。