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目的:观察慢性肾衰竭(chronic renal failure,CRF)湿热证患者血e NOS、ET-1、IL-1β、MCP-1、v WF、TM的水平表达情况及清肾颗粒干预作用。方法:将64例CRF湿热证患者(预计60例,增加<15%的剔除和脱落病例数)作为研究对象,随机分为治疗组与对照组,各32例,试验过程中共剔除4例,完成临床试验共60例,两组各30例。选取30例健康人员作为正常对照组(选自我院健康管理中心,用来检测血清e NOS、ET-1及IL-1β、MCP-1及血浆v WF、TM水平)。受试两组均予降压、纠正贫血、调节钙磷代谢紊乱、中药保留灌肠等对症治疗。治疗组加用清肾颗粒,每天三次,一次一包,连续给药12周。12周后观察CRF患者血肌酐(Serum creatinine,Scr)、估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,e GFR)、e NOS、ET-1及IL-1β、MCP-1及v WF、TM的变化情况并进行疗效评价。应用SPSS 23.0进行数据分析。结果:1.临床疾病疗效:治疗组总有效率(80.00%),对照组(60.00%),有明显差异(P<0.05)。2.中医证候疗效:治疗组总有效率(86.67%),对照组(53.33%),有明显差异(P<0.05)。3.中医证候积分:治疗前,两组积分值差异不明显(P>0.05);连续给药12周后,治疗组积分呈明显下降(P<0.01),且积分值低于同期对照.组(P<0.01);对照.组前后积分值无明显变化(P>0.05)。4.肾功能(Scr、e GFR):治疗前,两组肾功能差异不明显(P>0.05);连续给药12周后,治疗组患者Scr显著下降(P<0.01),e GFR显著升高(P<0.01),较对照组比较,Scr水平降低,e GFR升高,差异明显(P<0.01);对照组治疗前后肾功能无明显变化(P>0.05)。5.e NOS、ET-1水平比较:5.1治疗前:CRF湿热证患者e NOS水平明显低于正常组(P<0.01),ET-1水平明显高于正常组(P<0.01),治疗组与对照组之间差异无显著性(P>0.05);5.2治疗12周后:两组受试患者血清e NOS水平均较前升高(P<0.05或0.01),且治疗组升高幅度明显大于对照组(P<0.01);治疗组与对照组患者血清ET-1水平均较前下降(P<0.05或0.01),且治疗组降低幅度明显大于对照组(P<0.01)。6.IL-1β、MCP-1水平比较:6.1治疗前:与正常组相比,CRF湿热证患者IL-1β、MCP-1水平均明显升高(P<0.01),治疗组与对照组之间差异无显著性(P>0.05);6.2治疗12周后:两组受试患者血清IL-1β、MCP-1水平不同程度下降(P<0.05或0.01),且治疗组降低幅度明显大于对照组(P<0.01)。7.TM、v WF水平比较:7.1治疗前:与正常组相比,CRF湿热证患者TM、v WF水平均明显升高(P<0.01),治疗组与对照组之间差异无显著性(P>0.05);7.2治疗12周后:两组受试患者血浆TM、v WF水平均较前降低(P<0.05或0.01),且治疗组降低幅度明显大于对照组(P<0.01)。8.安全性观察:药物干预12周后,治疗组患者各项安全性指标无明显变化。结论:1.CRF湿热证患者血清e NOS水平降低、ET-1水平升高,血清IL-1β、MCP-1及血浆TM、v WF水平均升高;2.清肾颗粒可调节CRF湿热证患者血清e NOS、ET-1水平,降低血清IL-1β、MCP-1及血浆TM、v WF水平,改善血管内皮细胞炎性损伤;3.清肾颗粒可提高CRF湿热证患者生活质量及延缓肾衰进程,减轻血管内皮炎性损伤是其机制之一;4.本研究使用清肾颗粒期间未出现药物不良反应,证实该药良好的安全性。目的:检测5/6肾切除大鼠肾组织血管内皮损伤标志分子(e NOS、ET-1)及炎性细胞趋化因子(IL-8、MCP-1)的表达情况及肾脏病理变化;观察不同剂量清肾颗粒对5/6肾切除大鼠肾组织血管内皮细胞炎性损伤及肾纤维化的干预作用。方法:选用雄性SD大鼠72只,2月龄,清洁级,体重200±20g。适应性饲养1周后以单纯随机抽样分为6组,各12只,包括假手术组,模型组,清肾颗粒低、中、高剂量组,氯沙坦组。除假手术组外,其余60只大鼠均制作5/6肾切除模型。各组动物均在造模成功后第1天开始灌胃给药,清肾颗粒各组分别给予相应剂量清肾颗粒水溶液;氯沙坦组给予氯沙坦钾片混悬液;假手术组、模型组以生理盐水灌胃。每次4ml,每天1次,连续给药12周后,代谢笼收集24小时尿液,无菌采取腹主动脉血及左肾,检测血肌酐(serum Creatinine,Scr)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、24小时尿蛋白定量(24-hoururine protein,24h Upro),计算内生肌酐清除率(Creatinine Clearance,Ccr);RT-PCR法检测肾组织中一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthetase,e NOS)和内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)的m RNA表达水平;免疫组化法检测肾脏组织中白细胞介素-8(Interleukin8,IL-8)和单核细胞趋化因子-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、e NOS、ET-1的阳性表达;免疫荧光三染检测CD31(血小板-内皮细胞粘附分子)+IL-8+MCP-1、CD31+e NOS+ET-1在肾组织中的表达情况;采用HE、MASSON、PAS染色在光镜下观察各组大鼠肾组织病理改变。结果:1.肾功能:1.1血Scr、BUN、24h Upro:模型组与各药物干预组大鼠血Scr、BUN及24h Upro水平较假手术组显著升高(P<0.01);各治疗组大鼠血Scr、BUN及24h Upro水平较模型组均有所下降(P<0.01或0.05);清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组上述指标下降幅度最大(P<0.01);清肾颗粒高剂量组上述指标较氯沙坦组均有所降低(P<0.05),清肾颗粒中、低剂量组较氯沙坦组差异不明显(P>0.05)。1.2 Ccr:与假手术组比较,模型组与各药物干预组大鼠Ccr降低,差异显著(P<0.01);各药物干预组Ccr较模型组均有所升高(P<0.01);清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组Ccr升高幅度最大(P<0.01);与氯沙坦组比较,清肾颗粒高剂量组大鼠Ccr升高(P<0.05),清肾颗粒中、低剂量组Ccr无显著性差异(P>0.05)。2.血浆TM、v WF:与假手术组比较,模型组与各药物干预组大鼠血浆TM、v WF水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,各药物干预组上述指标均有所降低(P<0.01或0.05);清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组上述指标降低幅度最大(P<0.01);与氯沙坦组比较,清肾颗粒高剂量组大鼠血浆TM、v WF水平降低(P<0.05);清肾颗粒中、低剂量组无显著差异(P>0.05)。3.肾组织e NOSm RNA、ET-1m RNA表达情况(RT-PCR):3.1 e NOSm RNA:与假手术组比较,模型组与各药物干预组大鼠肾脏e NOSm RNA表达显著降低(P<0.01);各药物干预组大鼠e NOSm RNA表达较模型组不同程度升高(P<0.01);清肾颗粒各剂量组相比,高剂量组升高幅度最大(P<0.01);与氯沙坦组比较,清肾颗粒高剂量组大鼠肾脏e NOSm RNA表达升高(P<0.05),清肾颗粒中、低剂量组无显著差异(P>0.05)。3.2 ET-1m RNA:与假手术组比较,模型组与各药物干预组大鼠肾脏ET-1m RNA表达显著升高(P<0.01);各药物干预组大鼠ET-1m RNA表达较模型组不同程度降低(P<0.01);清肾颗粒各剂量组相比,高剂量组降低幅度最大(P<0.01);与氯沙坦组比较,清肾颗粒高剂量组大鼠肾脏ET-1m RNA表达降低(P<0.05),清肾颗粒中、低剂量组无显著差异(P>0.05)。4.肾组织e NOS、ET-1、IL-8、MCP-1免疫组化染色:4.1 e NOS:假手术组肾小球及部分肾小管可见棕黄色颗粒沉积;模型组沉积明显减少;相较于模型组,各药物干预组可见棕黄色颗粒沉积不同程度增加,以清肾颗粒高剂量组沉积最多,氯沙坦组次之。4.2 ET-1、IL-8、MCP-1:假手术组肾小球及部分肾小管均可见棕黄色颗粒沉积;模型组沉积明显增多;相较于模型组,各药物干预组可见棕黄色颗粒沉积不同程度减少,以清肾颗粒高剂量组沉积最少,氯沙坦组次之。5.肾组织中e NOS,ET-1,IL-8,MCP-1的平均密度:5.1 e NOS:与假手术组比较,模型组及各药物干预组大鼠肾组织e NOS平均密度明显降低(P<0.01);与模型组比较,清肾颗粒各剂量组及氯沙坦组大鼠e NOS平均密度均有所增加(P<0.01);..清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组增加幅度最大(P<0.01);与氯沙坦组比较,清肾颗粒高剂量组大鼠e NOS平均密度升高(P<0.05),清肾颗粒中、低剂量组无显著性差异(P>0.05)。5.2 ET-1、IL-8、MCP-1:与假手术组比较,模型组及各药物干预组大鼠肾组织ET-1、IL-8、MCP-1平均密度均显著增加(P<0.01);.清肾颗粒各剂量组及氯沙坦组上述指标较模型组均有所降低(P<0.01或0.05);清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组降低最显著(P<0.01);与氯沙坦组比较,清肾颗粒高剂量组上述指标均有所降低(P<0.05),清肾颗粒中、低剂量组上述指标无显著性差异(P>0.05)。6.肾组织CD31+e NOS+ET-1、CD31+IL-8+MCP-1免疫荧光三染表达情况6.1 CD31+e NOS+ET-1:CD31在假手术组呈明亮绿色荧光,模型组及各药物干预组呈不同程度下降;e NOS和ET-1在假手术组均有表达,分别呈橙色和红色荧光;e NOS在模型组表达明显减弱;各药物干预组e NOS表达较模型组不同程度增强,其中以清肾颗粒高剂量组表达最显著,可见明亮橙色荧光;ET-1在模型组表达显著增强,呈明亮红色荧光;各药物干预组ET-1表达较模型组不同程度减弱,其中以清肾颗粒高剂量组表达最弱。6.2 CD31+IL-8+MCP-1:CD31在假手术组呈明亮绿色荧光,模型组及各药物干预组呈不同程度下降;IL-8和MCP-1在假手术组均有表达,分别呈橙色与红色荧光;二者在模型组表达显著增强,呈明亮橙色与红色荧光;二者各药物干预组表达不同程度减弱,其中以清肾颗粒高剂量组表达最弱。7.肾脏病理改变:假手术组大鼠肾组织未见明显病理改变;模型组大鼠肾组织可见肾小球结构不完整,部分肾小球硬化,肾小管管腔扩张及上皮细胞空泡变性,甚至萎缩、坏死及脱落,肾间质区域增宽,可见大量炎性细胞浸润及蓝染胶原纤维分布;相较于模型组,各药物干预组上述病理改变均有所减轻,其中以清肾颗粒高剂量组及氯沙坦组减轻最为明显。结论:1.5/6肾切除大鼠存在肾组织内皮细胞活性因子表达失衡,炎性因子表达增加;2.清肾颗粒可显著降低5/6肾切除模型大鼠血Scr、BUN及24h Upro水平,升高Ccr,延缓肾功能损害进程;3.清肾颗粒可减轻5/6肾切除大鼠肾组织病理损伤程度;4.清肾颗粒可通过调节肾组织血管内皮衍生性舒缩因子e NOS、ET-1之间的平衡,抑制炎症因子IL-8、MCP-1的表达,从而减轻血管内皮炎性损伤,发挥其抗肾纤维化的作用。