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球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一种重要的昆虫病原真菌,其分生孢子为圆形,菌落颜色一般为白色,可制作成真菌孢子制剂用于害虫防治。体壁穿透是球孢白僵菌侵染昆虫的主要途径。昆虫体壁主要由蛋白质和几丁质组成,蛋白质占大多数并且将几丁质包裹在内。在球孢白僵菌侵染昆虫的过程中蛋白酶发挥着至关重要的作用,目前已知丝氨酸蛋白酶枯草芽杆菌类蛋白酶Pr1和胰蛋白酶类Pr2对昆虫表皮具有降解作用。在宿主为家蚕时,天冬氨酸蛋白酶栗疫蛋白酶类Bbepn L-1也对其表皮具有降解作用。在前期实验中,本实验室分离出一株对家蚕具有高毒力的菌株GXsk1011,该菌株在穿透家蚕体壁时,一共检测到4个天冬氨酸蛋白酶类基因Endothiapepsin-like proteins,其中3个基因上调表达。本实验室已研究报道敲除其中一种栗疫蛋白酶类基因Bbepn L-1后,菌株对家蚕的毒力降低,外源表达该蛋白发现其对家蚕体壁有降解作用。本研究以另一个上调表达的基因栗疫蛋白酶类Bbepn L-2为研究对象,克隆该基因并进行生物信息学分析,用毕赤酵母表达系统表达蛋白Bbepn L-2,通过检测蛋白酶活性,探索该蛋白在侵染家蚕时的作用,同时检测Bbepn家族相关基因的表达谱,初步分析该类蛋白在感染和致病过程中的表达特征。主要研究方法及结果如下:1.Bbepn L-2基因的克隆及生物信息学分析提取球孢白僵菌GXsk1011总RNA,反转录c DNA,高保真PCR克隆得到Bbepn L-2基因。生物信息学分析结果显示,该基因总长1197 bp,编码398个氨基酸,预计蛋白分子量为42.9 KDa,在N端处有信号肽,有1个糖基化位点。Bbepn L-2蛋白含有Aspergillopepsin-like保守结构域,属于天冬氨酸蛋白酶家族中的胃蛋白酶和逆转录蛋白酶类超家族。N端和C端各有1个高度保守的天冬氨酸蛋白酶活性位点Asp-Thr-Gly。活性位点内无突变,并且位于蛋白的中心,共同催化肽键水解。Bbepn L-2与Beauveria bassiana A2860同源性高达97%。2.Bbepn L-2的外源表达一步克隆法构建了重组表达质粒Bbepn L-2-p PIC9K,转入毕赤酵母感受态细胞GS115。通过不含组氨酸的培养基筛选阳性转化子,接种于G418浓度梯度培养基,筛选高拷贝菌株,最后对筛选菌株进行PCR测序验证。引物选择5’AOX/3’AOX,电泳结果显示有两条带,分别为2200 bp（AOX1）和1700 bp（Bbepn L-2相关）的条带。选择成功构建的高拷贝菌株进行甲醇诱导表达菌株,对发酵上清液进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示在45 KDa处有目的蛋白条带,在96 h蛋白表达量最高。通过组氨酸标签进行Western Blotting检测,确定45 KDa处条带为Bbepn L-2。大量发酵并收集发酵上清,硫酸铵盐析浓缩蛋白,Ni-NTA树脂纯化浓缩Bbepn L-2用于后续功能验证。3.Bbepn L-2的活性检测以酪蛋白为底物测定重组蛋白酶Bbepn L-2酶活,在酸性条件下酶活为291.542 U/g,SDS-PAGE检测Bbepn L-2处理家蚕表皮后的上清,在15 KDa处未检测到小分子肽,扫描电镜观察重组蛋白酶Bbepn L-2处理后的家蚕表皮,与PBS对照组相比,实验组表面沟壑相对光滑和平整但无降解痕迹,推测重组蛋白酶Bbepn L-2对家蚕表皮没有降解作用。4.Bbepn家族基因表达特征的检测使用家蚕表皮培养基诱导培养球孢白僵菌GXsk1011,提取不同时间段球孢白僵菌总RNA,反转录c DNA,q RT-PCR体外检测Bbepn家族基因表达特征。Bbepn L-2在12-96 h期间一直处于高表达状态,12-36 h时表达量呈上升趋势,36h表达量达最高值。Bbepn L-1和BBA＿3607表达量在24 h表达量最高,随后开始降低。球孢白僵菌侵染家蚕12 h时孢子已经全部萌发并附着于家蚕表皮,24 h菌丝穿透表皮进入家蚕体内。在这个时间段Bbepn家族基因表达量都呈上升趋势,表明它们受家蚕表皮激活并参与球孢白僵菌穿透家蚕表皮的过程。综上研究,本文成功了克隆基因Bbepn L-2,通过生物信息学分析初步了解蛋白结构和功能,外源表达蛋白Bbepn L-2。虽然Bbepn L-2具有一定的酶活性,但作用于家蚕表皮时,并未发现家蚕表皮被Bbepn L-2降解。同家族基因Bbepn表达谱检测结果显示,3个基因表达量随时间不同呈现出不同的表达特征。