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本研究开发了一种新型的非病毒基因传递系统。通过利用多聚阳离子PEI压缩质粒DNA,然后用PEG化的脂质体包裹PEI/pDNA压缩体,形成脂质复合载体LPD,并将人胰岛素受体的单克隆抗体(8314-SA)与脂质中的DSPE-PEG2000-biotin中的生物素基团(biotin)共轭,形成以单克隆抗体(MAb)为靶向基团的复合载体(8314-LPD),MAb提高了复合载体的靶向能力。8314-LPD是一种肝主动靶向四元长循环基因载体制剂。其具体研究内容及结果如(?)首先用转化的大肠杆菌扩增含有报告基因的质粒DNA (PEGFP-C1),再用QIAGEN无内毒素大提试剂盒提取质粒DNA,并对其浓度和质量进行评定。然后分别制备出PEG化的脂质体(脂质处方为POPC 94%, DDAB 2%, DSPE-PEG2000 3%和DSPE-PEG2000-biotin 1%)和PEI/pDNA聚阳离子压缩体,用所得脂质体包裹PEI/pDNA压缩体形成了LPD复合物。单因素实验结合均匀设计实验优化LPD处方,单因素实验考察结果为：质粒浓度在40μg/ml以下,粒径变化不大,浓度增大,复合物粒径增大；N/P超过1.5时,质粒的包封完全,随着N/P的增大,复合物粒径减小,电位增大,在N/P等于15时,粒径最小,再增大N/P,粒径基本不再发生变化；脂质/pDNA的摩尔比在50：1时,酶切电泳显示脂质可以完全包封PEI/pDNA压缩体,随着脂质/pDNA的比例增大,LPD的粒径减小,电位降低,在170：1时粒径最小,脂质/pDNA的摩尔比再增大,复合物粒径开始变大。均匀设计实验优化LPD复合物处方的结果为：在pH 7.0的HEPES缓冲液中,质粒浓度为40μg/ml,N/P=15,脂质/pDNA=170:1时,制备的LPD平均粒径为130 nm,平均zeta电位为1.5mV。进一步对LPD进行结构修饰,在外层脂质膜的PEG链上偶联抗人胰岛素受体的单克隆抗体(8314-SA),形成肝主动靶向的单克隆抗体修饰的Lipo/PEI/pDNA复合物(8314-LPD)。透射电镜下观察,肝靶向8314-LPD复合物的近似球形,形态规整,无粘连；对其粒径电位分析,平均粒径在150nm左右,电位在4.5mv左右。以绿色荧光蛋白基因PEGFP-C1作为报告基因考察复合物对质粒的酶切保护能力,凝胶电泳分析实验证明这种基因载体能有效地保护质粒DNA免受DNA酶(?)NaseⅠ)降解；血清稳定性实验表明8314-LPD复合物可以在血清中稳定存在；长期稳定性实验考察结果,4℃和25℃氮气密封贮存,复合物粒径都有所增大,但变化幅度不同,说明温度对复合物的稳定性有明显的作用,25℃贮存会使复合物粒径在一个月内发生非常大的增大。体外的细胞转染实验和细胞毒性实验分析,LPD载体的转染效率小于PEI/pDNA压缩体,但是经单克隆抗体修饰后,8314-LPD基因载体能够很好的被人肝癌细胞SMMC-7721摄取,与前两组基因载体相比,转染率有明显的提高。MTT实验中显示LPD和8314.-LPD复合物的毒性都明显小于PEI/pDNA多聚阳离子压缩体。为了提高8314-LPD复合物的长期稳定性,通过冷冻干燥法将其制备成冻干粉针剂。具体步骤是,首先筛选优质冻干保护剂,通过考察冻干粉的外观,色泽,表面细化程度,再分散能力,发现海藻糖制备的冻干粉外观不塌陷,不起泡,色泽均匀,质地细腻；复溶后,再分散时间短；复溶后,复合物的粒径和Zeta电位基本没有变化,是载体的最优保护剂。其次,对冻干粉进行质量评价,通过对冻干粉复溶后抗酶切实验,发现经冻干复溶后的制剂仍能保持抗核酸酶能力,说明载体结构在冻干过程中没有受到破坏。转染实验证明,经冻干复溶的载体的转染活性也基本没有变化。本研究结果表明,8314-LPD复合物制备方法简单易行,能够有效保护质粒DNA不被核酸酶降解,复合物的血清中稳定性和细胞转染率都比较高,细胞毒性小,并可通过冷冻干燥法制备出性质稳定可长期保存的冻干粉针剂。这种肝主动靶向的长循环免疫基因载体,综合利用了阳离子多聚物和脂质体的优点,克服了二者的缺点,相信在肝癌的基因治疗中,将会有很好的发展前景。