恐惧是生物体对外界已经或即将出现的危险因素所作出的防护性反应。这种反应是生物体在进化过程逐渐形成的,主要包括行为(如僵持、逃跑及战斗等)、内分泌系统(如去甲肾上腺素等应激激素大量分泌)及自主神经系统(如呼吸减慢、心跳加快等)等方面的反应。适度的恐惧对于高等生物的生存是不可或缺的。相反,过度以及不适时的恐惧表达则是广泛性焦虑症、创伤后应激综合征、惊恐症等许多精神疾病的主要症状之一。已有证据表明,在几近一半的精神疾病患者中,均可出现明显的恐惧及焦虑等相关障碍,而恐惧及焦虑的发生则可明显加剧所罹患精神疾病的发展。人们对恐惧产生的大脑机制进行了长期的研究。尤其在最近数十年,大量的实验及临床证据表明,大脑杏仁核对恐惧的产生具有十分关键的作用。早期使用电及化学等方法毁损杏仁核的实验研究表明,杏仁核毁损可引起动物在危险事物出现时,恐惧反应明显降低以至消失。而颅内注射GABAR激动剂蝇蕈醇(muscimol)等抑制杏仁核的活动同样可以降低动物对恐惧的学习能力。在临床上,人们使用功能性核磁成像技术发现,在外界危险刺激出现时,大脑杏仁核的活动明显增强;并且,与正常人群相比,焦虑症病人杏仁核的活动也明显增强。这一系列的证据均提示杏仁核是介导恐惧反应的关键脑区。杏仁核位于大脑颞叶深部,是由外侧核(lateral amygdala,LA)、基底核以及内侧核等十多个核团组成的复合体。目前认为,LA是杏仁核最为主要的感觉输入区域,而中央核则是杏仁核将输入信息整合后,输出到脑干等脑区的主要区域。与周围脑区相比,杏仁核在静息状态下的活动明显低下,呈现出很高的抑制状态。已有大量研究表明,这种高抑制状态对于维持杏仁核正常的生理功能是不可或缺的。电生理学及解剖学的证据提示,杏仁核内存在十分特殊的抑制性神经元网络维持着这种高抑制状态。杏仁核的抑制性神经元网络主要是由核内的局部神经元以及位于外侧传导束及基底核与中央核之间的间细胞群(intercalated cell mass,ITC)组成。ITC 内的 INs(interneurons)不仅数目众多,而且具有很高的输入阻抗和兴奋性,因此可对杏仁核内PNs(pyramidalneurons)产生显著的抑制作用。杏仁核抑制状态的异常将直接导致一系列神经精神疾病的发生。一些临床研究已经报道杏仁核活动水平的增加与焦虑症的发生率成正相关[1]。与脑内的其他区域相同,杏仁核的抑制状态主要由抑制性INs释放γ-氨基丁酸(GABA)所引起。GABA的释放可以激活离子型的γ-氨基丁酸A型受体(GAB AA receptors,GAB AARs)以及代谢性的GABABR。目前的研究认为,GABAARs的激活主要介导了两种形式的中枢性抑制:即由突触内受体介导的时相性抑制(phasic inhibition)及突触外受体介导的紧张性抑制(tonic inhibition)。这两种形式的抑制在产生部位、受体的亚基组成、对GABA的敏感性及抑制的持续时间等方面均存在着明显的不同。一般认为,时相性抑制主要是由突触前囊泡释放GABA递质,并短暂而迅速激活位于突触后膜的GABAARs引起。因此,时相性抑制可以将突触前活动快速、准确地转化为突触后信号。神经细胞的电压钳高分辨率记录表明,时相性抑制的持续时间约为数百毫秒[2]。相反,紧张性抑制则是由突触周围及突触外的GABAARs被弥散在其周围的低浓度GABA激活后所引起,它以一种紧张性的方式持续存在。激活方式的不同,提示它们在调控神经元网络活动中可能有着本质性的区别。在成熟中枢神经系统中,时相性抑制的基本功能是下调靶神经元的兴奋状态,避免单个神经元以及整个神经网络的过度兴奋。此外,时相性抑制的另一个重要功能是调控神经网络的节律性活动。通过定相和同步大量PNs的活动,INs在神经元网络THETA及GAMMA节律活动的产生和维持中发挥了根本性作用[3]。相对于突触内受体介导的时相性抑制,突触外受体介导的紧张性抑制可以持续增加神经元细胞的氯离子输入电导。尽管很多研究已经表明突触外紧张性抑制与一系列认知、情感、及精神疾病相关,人们对紧张性抑制在神经系统中的作用及机制的了解还处于初始阶段。如今,对产生紧张性抑制的突触外GABAARs在分子组成、细胞膜定位以及其对神经系统生理学上的影响等方面的研究已经引起科研人员的广泛兴趣[4]。目前已经发现,生理条件下的紧张性抑制主要由包含α5或δ亚基的GABAARs介导。譬如,在海马齿状回,紧张性抑制主要由含α5亚基的GABAARs介导。而在小脑颗粒细胞上,介导紧张性抑制的GABAARs则含有δ亚基及α6亚基。为了研究杏仁核内是否存在由突触外GABAARs介导的紧张性抑制,我们首先使用全细胞膜片钳技术,在IN GFP基因敲入小鼠(GAD67-GFP小鼠,3.5-4.5周)LA脑区上研究PNs和INs相关的电生理学特性。首先,我们形成全细胞记录,将细胞钳制在-70mV(高氯电极内液),在Gap-free模式下分别记录LA PNs和INs上自发的抑制性突触后电流(spontaneous inhibitory postsynaptic currents,sIPSCs)比较荷包牡丹碱(BMI)对PNs及INs的抑制作用。结果显示:BMI阻断PNs和INs的紧张性抑制(pA/pF)分别为0.015 ± 0.008和0.114 ±0.039。两组比较有显著性差异(P<0.05)。我们观察到,PNs和INs的sIPSCs均能被10μM BMI阻断。同时,在INs上,BMI在阻断sIPSCs的同时,其记录基线明显上移,提示钳制电流减少。这种由BMI引起的钳制电流的减少,提示在INs上存在着明显的紧张性抑制。相反,在PNs上,BMI仅仅阻断其sIPSCs,但对其钳制电流没有明显影响。为了进一步确认该实验结果,我们将钳制电压上升到OmV(低氯电极内液),再在Gap-free模式下分别记录PNs和INs的sIPSCs,并比较BMI对PNs及INs的抑制作用。结果显示:BMI阻断PNs及INs的紧张性抑制(pA/pF)分别为-0.024 ± 0.006和-0.297±0.066,两组比较具有显著性差异(P<0.001)。该结果同样表明,紧张性抑制主要存在于INs上,而PNs上则很少有紧张性抑制的存在。PNs和INs间紧张性抑制的存在差异可能有两个方面的原因:PNs上表达了突触外GABAARs但其周围GABA浓度较低,不足以激活突触外GABAARs;PNs上没有表达突触外GABAARs。为了测试第一种可能,我们用20μM的GABA灌流脑片,并观察BMI是否同样对PNs和INs记录基线产生不同影响。我们发现,在细胞外存在20μM GABA的情况下,使用BMI灌流同样仅引起INs基线的漂移,而对PNs的基线没有明显影响。PNs和INs的紧张性抑制(pA/pF)分别为0.036 ±0.019和0.201 ± 0.048,两组比较具有显著性差异(P<0.05)。该结果提示:GABAARs介导的紧张性抑制在这两种细胞类型间的存在差异并不是由其周围的GABA浓度差异所引起。鉴于介导紧张性抑制的突触外GABAARs有着多种亚型,我们需要探索杏仁核INs上存在的紧张性抑制是由哪些突触外GABAARs亚型介导的。我们首先使用含δ亚基的GABAARs特异性激动剂THIP,尝试确定该类受体在杏仁核INs中是否存在。将神经细胞钳制在-70mV后,在人工脑脊液里先后加入低浓度的THIP(1-2μM)以及BMI持续灌流,观察其对PNs和INs钳制电流的影响。我们发现,在PNs上,THIP没有引起钳制电流的显著变化,紧张性抑制(pA/pF)为-0.027 ±0.012,而BMI有效地抑制了 sIPSCs,但同样对钳制电流没有产生明显影响,紧张性抑制(pA/pF)为-0.005 ±0.009。相反,在INs上,THIP灌流则显著提升了其钳制电流(基线向下移动),紧张性抑制(pA/pF)为-0.168±0.045,BMI则在有效阻断sIPSCs的同时引起其钳制电流的减少(基线向上移动),紧张性抑制(pA/pF)为0.054 ±0.027。其中,THIP激活两类神经元紧张性抑制比较具有显著性差异(P<0.05)。上述结果表明:INs上存在含δ亚基的GABAARs介导的紧张性抑制,而该类抑制在PNs上并不明显。为了进一步验证上述实验结果,我们将细胞钳制到OmV进行重复,结果得到了类似的发现。其中,THIP激活PNs和INs的紧张性抑制(pA/pF)分别为0.105 ± 0.019和0.609 ± 0.126。BMI阻断PNs和INs的紧张性抑制(pA/pF)分别为-0.012 ± 0.014和-0.163 ±0.135。THIP激活两类神经元紧张性抑制比较具有显著性差异(P<0.001)。为了进一步确认含δ亚基的GABAARs在LA PNs和INs上的表达差异,我们用免疫组化的方法从形态学上观察含δ亚基的GABAARs在这两类神经元上的表达。我们在GAD67-GFP阴性小鼠上,用CaMKII 一抗标记PNs细胞,用GABAARs δ亚基特异性一抗标记表达δ亚基的神经元细胞,观察这两种抗体是否共存于PNs上;而在GAD-67GFP阳性小鼠上,我们结合INs自带的GFP绿色荧光观察δ亚基是否存在于GFP阳性的INs上。结果显示:PNs极少有表达含δ亚基的突触外GABAARs;相反,大部分INs表达含δ亚基的突触外GABAARs。进一步,我们同龄C57小鼠的免疫组化实验结果表明:含δ亚基的突触外GABAARs主要在parvabumin阳性的INs上表达。随后,我们对含δ亚基的突触外GABAARs在LA中的可能功能进行研究。我们首先探讨这类受体对LA PNs和INs胞体兴奋性的调控。在电流钳的模式下,我们分别向PNs和INs注射递增的去极化电流,诱发PNs和INs产生一定数目的动作电位,且神经元动作电位发放的数目会随注射电流强度的增加而逐步增加。随后,我们加入BMI阻断紧张性抑制,分别比较其对PNs和INs胞体兴奋性的影响。结果显示,BMI并没有对PNs动作电位的发放数目产生明显影响,相反,在使用BMI后,INs在相同刺激强度下爆发出更多的动作电位。BMI对INs动作电位发放数目的影响很可能是通过阻断紧张性抑制而不是时相性抑制所引起的。这是因为PNs上存在比INs更为丰富的时相性抑制,但这些时相性抑制的阻断并未对PNs动作电位的发放数目产生影响。该结果提示自发产生的时相性抑制并不能对神经元胞体的兴奋性产生明显影响。该结果表明,紧张性抑制显著降低了 INs胞体的兴奋性。上述结果提示,在LA,紧张性抑制主要存在于INs上,但由于杏仁核PNs的活动受到INs的广泛抑制性调控,紧张性抑制可能通过调控INs的活动状态进而影响PNs的活动状态。因此,我们进一步研究含δ亚基的GABAARs对PNs的调控作用。我们将刺激电极放置在杏仁核的内侧及外侧传导束,分别激活来自丘脑和皮层的感觉纤维输入。在电压钳模式下,将PNs钳制在-40mV,逐步增加刺激电极的强度,直至在PNs上同时记录到明显的双向电流(EPSC/IPSC)。其中,IPSC是由感觉纤维输入兴奋INs后,对PNs产生的前馈性抑制。随后,在人工脑脊液中加入THIP,激活INs上含δ亚基的GABAARs,观察THIP对PNs EPSC/IPSC的调控作用。我们发现,无论将刺激电极放置在内侧或者外侧束,THIP均选择性地降低了 IPSC的幅度,但对EPSC则没有明显影响。由于PNs上没有明显的含δ亚基的GABAARs的表达,因此,THIP的上述作用主要是通过影响INs而实现。THIP可以抑制INs的发放活动,从而使其对PNs的抑制性调控减弱,导致其IPSC幅度明显降低。虽然THIP没有直接影响PNs的EPSC,但明显降低其IPSC可以使PNs的兴奋性输出相对增强。因此,本实验提示,含δ亚基的突触外GABAARs在调控杏仁核正常生理功能方面发挥了重要作用。总之,本研究发现,在LA,紧张性抑制在LAPNs和INs上呈现出明显不同的存在差异:INs上存在明显的紧张性抑制;相反,PNs上的这类抑制极其微弱。而这种差异并不是由PNs和INs其周围的GABA浓度差异所引起。我们进一步证实,含δ亚基的GABAARs直接介导了 INs上的紧张性抑制。紧张性抑制可以显著降低INs的兴奋性,间接下调其对PNs的抑制性输入,从而有效地保证PNs的兴奋性输出。对含δ亚基GABAARs在杏仁核神经元上的表达及功能进行深入研究,将为探索相关受体在调控恐惧与焦虑及相关障碍发生中的作用提供必要的理论基础。