端粒酶（telomerase）是真核细胞内的一种核糖核蛋白复合体，由基本的催化部分端粒酶反转录酶TERT（telomerase reverse transcriptase）和RNA组分TR（telomerase RNA）组成，是一种特殊的DNA聚合酶，具有延伸DNA末端的功能，能够维持端粒长度和功能，RNA亚基为端粒的合成提供模板，TERT具有反转录酶活性。在大多数体细胞和原代细胞中，端粒酶活性很低，通常检测不到，但在肿瘤细胞中，端粒酶则被广泛激活，这是维持细胞分裂及克服端粒序列不断丢失所必须的。端粒是位于染色体末端的串联重复核苷酸序列。不同的物种具有不同的重复序列。端粒功能主要是维持染色体的稳定：即在维持细胞核三维空间结构和确保染色体复制完整性方面起着重要作用。端粒酶催化亚基活性中心cDNA的克隆 端粒酶催化亚基活性中心为含1、2、A、B、C、D基序的cDNA，全长为1764bp。本实验采用RT-PCR技术，应用高保真DNA聚合酶从人喉癌细胞中扩增端粒酶催化亚基活性中心基因片段，经琼脂糖凝胶电泳，在接近2Kb处出现特异片段，并将其连入pMD18-T载体中，转入JM109细胞中，提取质粒，采用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，获得了2Kb的片段，用BamHⅠ酶切阳性质粒，鉴定连入质粒的cDNA方向，同时采用嵌套PCR鉴定连入质粒的基因的正确性，将鉴定理想的质粒进行测序，获得正确结果。端粒酶催化亚基活性中心cDNA的真核表达载体构建及表达 将克隆载体上hTERTcDNA用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收酶切产物，同时将真核表达载体pCR3.1也用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收酶切产物，将回收的hTERTcDNA和pCR3.1酶切产物进行连接，并转入JM109感受态细胞内，培养12-18h后，挑取阳性菌落，提取质粒，进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定，证明该cDNA已经成功连入真核表达载体pCR3.1中。采用鼎国公司生产的质粒快速提取试剂盒提取质粒，该质粒用于真核细胞转染。利用脂质体法将pCR3.1-hTERT2K质粒转染入无端粒酶活性细胞DK细胞，利用pCR3.1载体上带有强的CMV启动子，高效表达活性中心蛋白，以pCR3.1空质粒为对照。提取细胞总RNA，采用RT-PCR检测hTERT mRNA的表达情况，结果表明，在细胞内检测到了mRNA，证明该cNDA在细胞内确实得到了表达，经TRAP-ELISA检测未检测到端粒酶活性，证明hTERT5’端序列为端粒酶活性所必需，其功能为结合端粒酶RNA。