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桑树是多年生的重要经济作物,属桑科桑属,是家蚕的唯一饲料。桑树经长期的自然选择和人工选育,形成了丰富的桑树种质资源。但是,与其它植物相比我们在桑树功能基因研究等方面都处于落后状态。因此,研究桑树一些重要的基因及其胁迫环境下的分子作用机制,有利于提高桑叶产量及桑树资源的培养和保存。本文通过抑制消减杂交技术和同源性基因克隆获得了桑树的3个差异显著的ESTs序列,并根据获得的序列结合RT-PCR和RACE技术克隆得到了2个基因的全长cDNA序列。利用胁迫诱导和荧光定量PCR的方法对2个基因进行功能验证和表达分析。同时从桑树中克隆出了ANS基因序列,经过酶切、连接到表达载体1302上,为以后转到拟南芥上进行功能研究做准备。本文主要研究内容如下:(1)桑树紫芽与绿芽的消减抑制杂交花青素与桑树嫩芽的颜色表现有关,桑树中与花青素合成及调节相关的基因很多,本文以桑树紫芽与绿芽为材料,进行消减抑制杂交。所得杂交产物通过琼脂糖凝胶电泳得到差异条带群,可以看到差异显著的三个条带,进行回收测序,得到其中2条条带的EST序列。获得的EST序列经Blast比对和同源性分析,其中一条可能与花青素有关。(2)桑树两个花青素相关基因的全长克隆及胁迫情况下的表达分析从消减抑制杂交中获得的EST序列和从已构建的桑树幼叶cDNA文库得到了一个与花青素相关基因CHS3的一段序列,通过RACE与RT-PCR结合的方法获得了两个基因的全长,并命名为Ma-TCTP(基因登录号:KP228013)和Ma-CHS3。序列分析表明,Ma-TCTP该基因cDNA全长841bp,包括101bp的5′-UTR、233bp的3′-UTR,ORF为507bp,编码168个氨基酸,蛋白质分子质量为18.7362kD,等电点为4.53。同源分析表明,Ma-TCTP基因在各物种间具有很高的保守性。Ma-CHS3该基因cDNA全长1234bp,包括215bp的3′-UTR,ORF为1017 bp,编码338个氨基酸,蛋白质分子质量为36.7018kD,等电点为7.58。同源性分析表明,该基因与CHS同族基因序列相似性很高。花青素相关基因不仅与颜色有关,还与植物的抗逆性有关,定量PCR结果表明,Ma-TCTP和Ma-CHS3基因mRNA的转录水平在不同组织及低温、高温胁迫下的均有所不同,但其具体机制还有待进一步研究。(3)桑树ANS基因的表达载体构建从NCBI中已经得到的ANS序列,设计带酶切位点的引物,通过RT-PCR从桑树中得到ANS的全长cDNA序列,分别对ANS基因和1302表达载体进行酶切、纯化、连接,将ANS基因构建到1302载体上,测序确认。