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目的1.探讨蛋白激酶受体2（PAR2）在骨性关节炎（OA）软骨组织和软骨细胞中的表达。2.探讨PAR2拮抗剂AZ3451在体外对软骨细胞炎症、自噬、凋亡和衰老的影响,并探讨其具体作用分子机制。3.探讨在体内关节腔注射PAR2拮抗剂AZ3451对OA进展的影响。方法1.PAR2表达检测:前交叉韧带切除制备大鼠创伤后OA模型（PTOA）,免疫荧光检测PAR2在假手术组（Sham）和PTOA组关节软骨组织中的表达情况;Western-blot检测PAR2、Collagen Ⅱ和Aggrecan在IL-1β刺激软骨细胞中的表达情况。2.炎症代谢检测:Western-blot检测PAR2蛋白水平,筛选合适浓度的PAR2拮抗剂AZ3451;Western-blot检测AZ3451对IL-1β诱导的软骨细胞中炎症代谢指标（COX2,iNOS,ADAMTS5,MMP1及MMP13）和软骨基质指标（Collagen Ⅱ,Aggrecan）的影响。3.细胞衰老检测:Western-blot检测AZ3451对IL-1β诱导的软骨细胞中衰老标志性基因p16INK4a的影响;细胞衰老β-半乳糖苷酶染色检测衰老相关的β-半乳糖苷酶活性。4.细胞自噬检测:Western-blot检测IL-1β及AZ3451对软骨细胞自噬相关基因Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1和LC3的影响;GFP-RFP-LC3自噬双标腺病毒转染检测AZ3451对软骨细胞自噬强度及自噬流的影响。5.细胞凋亡检测:Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞仪分析来检测软骨细胞的凋亡率;Western-blot检测AZ3451对IL-1β诱导的促凋亡蛋白（BAX,Cyto C,Cleaved caspase 3）和抑凋亡蛋白Bcl-2的影响;线粒体膜电位检测软骨细胞早期凋亡;TUNEL染色检测软骨细胞晚期凋亡。6.自噬、凋亡及炎症之间相互作用:Western-blot检测在氯喹（CQ）作用下AZ3451对软骨细胞凋亡相关指标Cleaved caspase 3和自噬相关指标LC3的影响;TUNEL染色检测软骨细胞凋亡;Western-blot检测在氯喹（CQ）作用下AZ3451对炎症代谢相关蛋白Aggrecan、Collagen Ⅱ、ADAMTS5、MMP13和COX2的影响。7.信号通路检测:Western-blot检测MAPK、PI3K/AKT/mTOR和NF-κB信号通路变化;Western-blot检测P38/MAPK抑制剂SB203580、PI3K/AKT抑制剂LY294002和NF-κB抑制剂JSH-23联合AZ3451处理后软骨细胞基质Aggrecan和Collagen Ⅱ的变化;Western-blot检测P65核蛋白和浆蛋白变化;免疫荧光检测P65核转移变化。8.体内实验:用大鼠前交叉韧带切除PTOA模型研究在体内关节腔注射AZ3451对OA进展的影响;H&E、甲苯胺蓝及番红固绿染色检测软骨损伤程度;软骨组织MMP13、Cleaved-caspase3和Beclin1免疫组化及TUNEL染色验证AZ3451在体内对OA软骨自噬、凋亡及炎症代谢的影响。结果1.PAR2免疫荧光染色结果显示,相比于Sham组,PAR2在PTOA组软骨组织中显著高表达;随着IL-1β干预软骨细胞时间和浓度梯度逐渐增加,Collagen Ⅱ和Aggrecan表达逐渐减少,而PAR2蛋白表达水平逐渐增高。2.10μM浓度AZ3451可以显著抑制PAR2表达;PAR2拮抗剂AZ3451可以抑制IL-1β诱导的炎症代谢指标（COX2、i NOS、ADAMTS5、MMP1、MMP13）的表达;同时,AZ3451可以抑制IL-1β诱导的软骨基质指标Collagen Ⅱ和Aggrecan的降解。3.PAR2拮抗剂AZ3451可以显著抑制IL-1β诱导的p16INK4a蛋白水平和衰老相关的β-半乳糖苷酶活性。4.Western-blot结果显示IL-1β可以降低自噬相关基因（Atg5,Atg7,Atg12,Beclin1,LC3）的表达,抑制软骨细胞自噬;AZ3451可以显著逆转IL-1β诱导的自噬相关基因（Atg5,Atg7,Atg12,Beclin1,LC3）的表达的减少,抑制IL-1β诱导的软骨细胞自噬减少;软骨细胞转染GFP-RFP-LC3自噬双标腺病毒结果显示,AZ3451可以促进自噬体向自噬溶酶体的转化,从而提高自噬水平和增强自噬流。5.Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞仪分析结果显示AZ3451处理可以抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡;Western-blot结果显示AZ3451显著抑制了IL-1β诱导的软骨细胞促凋亡蛋白Cyto C,Cleaved caspase 3表达,并逆转软骨细胞中的BAX/Bcl-2比率;线粒体膜电位显示IL-1β刺激降低了软骨细胞线粒体膜电位,而AZ3451干预显著逆转了这一过程;TUNEL染色显示AZ3451干预明显减少了IL-1β诱导的TUNEL阳性细胞数。6.Western-blot结果显示,CQ显著抑制了AZ3451介导的Cleaved caspase 3表达的减少;同样CQ也显著削弱了AZ3451介导的TUNEL阳性细胞数的减少。Western-blot结果显示CQ干预降低了由IL-1β诱导的COX2、MMP13和ADAMTS5水平的增加并且抑制了Collagen Ⅱ和Aggrecan的降解。AZ3451和CQ的联合处理并不影响AZ3451对IL-1β诱导的炎症代谢因子（COX2,MMP13和ADAMTS5）的抑制作用。7.Western-blot结果显示PAR2拮抗剂AZ3451可以抑制IL-1β诱导的P38/MAPK,、NF-κB和PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活;P38/MAPK抑制剂SB203580、PI3K/AKT抑制剂LY294002及NF-κB抑制剂JSH-23和AZ3451联合治疗在抑制软骨基质降解方面发挥了更好的保护作用;AZ3451也可以抑制软骨细胞中IL-1β诱导的p65亚基向核内易位。8.H&E、甲苯胺蓝及番红固绿染色结果显示,相比与PATOA组,AZ3451治疗组OA软骨损伤程度明显减轻。三组软骨组织MMP13、Cleaved-caspase3和Beclin1免疫组化及TUNEL染色结果显示,在体内关节腔注射AZ3451可以抑制OA软骨细胞炎症、软骨细胞凋亡并促进软骨细胞自噬。结论1.PAR2在大鼠OA软骨组织和软骨细胞中显著高表达。2.在体外PAR2拮抗剂AZ3451可以抑制软骨细胞炎症、衰老和凋亡,促进软骨细胞自噬而发挥软骨保护作用,P38/MAPK,NF-κB和PI3K/AKT/mTOR信号通路参与了PAR2拮抗剂AZ3451在OA中保护作用的这一过程。3.关节腔注射PAR2拮抗剂AZ3451在体内可以抑制OA软骨细胞炎症代谢、软骨细胞凋亡并促进软骨细胞自噬而延缓OA进展,PAR2可以作为OA治疗的潜在靶标。