背景和目的：　　 肿瘤的治疗主要是采用多学科综合治疗的手段以达到提高患者生存时间和生活质量的目的。目前，喉癌主要采取以手术治疗为主、辅以放疗、化疗的综合治疗手段，但是肿瘤局部复发和远处转移往往是治疗失败的主要因素。在外科手术方式日益成熟的今天，恶性肿瘤外科治疗的远期生存率却无明显改善，因此大量研究致力于探索和改良手术以外的治疗手段的水平，希望能进一步提高喉癌的治疗效果。化疗作为喉癌的辅助治疗手段之一，它强调全身性的治疗。目前，临床上常用的头颈部鳞癌的基本化疗药物是顺铂和5-氟尿嘧啶。5-氟尿嘧啶是周期特异性药物，主要作用于S期，广泛应用于各种实体瘤，具有较强的抗肿瘤作用。但是，5-氟尿嘧啶在临床应用中存在不足：①体内半衰期短(5～10分钟)；②口服易被肠粘膜中的尿嘧啶还原酶分解，肝脏首过剂量大，只能静脉给药；③随剂量增加清除率降低；④代谢酶双氢嘧啶脱氢酶(DPD酶)个体差异大。这些问题严重影响了5-FU的疗效。目前，为了提高其抑瘤效果、减少毒副作用、降低耐药性，联合用药及改变药物剂型成为研究的热点之一。　　 纳米技术应用于医药领域，引起了药物剂型的大变革。两亲型嵌段共聚物载药纳米微球是90年代发展起来的新技术，是纳米药物载体的最新发展方向之一。它主要由疏水部分和亲水部分组成，在水中可自组装形成壳—核型结构，疏水部分位于核心，构成纳米微球的主要骨架，是主要的载药库；亲水部分构成微球的外壳，决定着微球的生物学性能。这种壳—核型结构具有较高的载药量，可产生体内独特分布，具有较高的生物相容性，在药物运输方面有着独特的优势。聚谷氨酸苄酯(poly(γ-benzyl-L-glutamic acid)，PBLG)是可生物降解型聚合物，其代谢产物可经体内排除，在体内不易产生蓄积和毒副作用；且具有较强的刚性和疏水性，常用作脂溶性药物的载体；但是PBLG制备的微球由于其疏水性表面，进入人体后容易被网状内皮细胞系统(reticular endothelial system，RES)快速摄取，难以发挥非单核吞噬细胞系统(mononuclear phagocyte system，MPS)的靶位效应。聚乙二醇(Poly(ethylene-glycol)，PEG)是被美国FDA承认的可用于人体的聚合物，无免疫原性，具有良好的生物相容性，是常用的水溶性载体之一，能够增加难溶性药物的溶解性，提高药物的生物利用度。因此将具有良好载药能力的PBLG与具有亲水性和柔顺性的PEG复合制备成聚乙二醇聚谷氨酸(Poly(ethylene glycol)-Poly(γ-benzyl-L-glutamate)，PEG-PBLG)共聚物，可改善PBLG微球制剂的疏水性表面，避免被RES吞噬，增加纳米的稳定性，便于控制缓释，提高载药率，延长半衰期，使药物在血液中存留时间延长，改变药物在组织的分布，是一种良好的缓释控释药物载体。　　 本课题拟将难溶性药物5-氟尿嘧啶包埋于两亲型嵌段共聚物聚乙二醇聚谷氨酸苄酯(PEG-PBLG)纳米微球，并进行其体内、外治疗喉癌作用研究以验证其抑瘤效果。　　 方法：　　 1阴离子聚合法制备PEG-PBLG两亲型嵌段共聚物，再以透析法制备5-FU/PEG-PBLG纳米微球。　　 2核磁共振波谱仪(H1NMR)测定PEG-PBLG共聚物的分子量；紫外线分光光度仪测定药物吸光度后计算载药率。扫描电镜、透射电镜检测纳米微球的大小、形态。　　 3透射电镜观察肿瘤细胞对纳米药物的摄取作用及细胞结构的变化。　　 4 MTT法检测不同浓度的空白对照组、PEG-PBLG组、5-FU组和5-FU/PEG-PBLG组的体外细胞毒作用，计算细胞生长抑制率及半抑制浓度(IC50)。　　 5流式细胞仪检测细胞周期时相的变化，比较5-FU和5-FU/PEG-PBLG对Hep2细胞周期的影响。　　 6在BALB/c裸鼠构建人喉鳞癌皮下移植瘤裸鼠模型。将动物分为生理盐水组(NS组)、PEG-PBLG组、5-FU组、5-FU/PEG-PBLG组，治疗组药物(20mg/kg)腹腔注射，隔天一次，共5次。比较肿瘤体积的变化，描绘肿瘤生长曲线，计算抑瘤率和肿瘤的倍增时间，通过病理切片观察组织病理变化。　　 7高效液相色谱法检测药物体内分布，比较5-FU和5-FU/PEG-PBLG组动物体内的组织分布差异。　　 8实验数据均以SPSS11.0软件进行统计学计算、分析，数据以均数±标准差((-x)±s)表示，用单因素方差分析和随机区组设计的方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。　　 结果：　　 1根据PEG链和PBLG链的峰面积之比计算出PEG-PBLG的分子量为18069.88；5-FU/PEG-PBLG纳米微球的载药率为6.52％。5-FU/PEG-PBLG纳米微球经透射电镜、扫描电镜显示为壳—核型结构，中心为疏水性的PBLG内核，外周为亲水性的PEG外壳。微球直径约为268nm，外壳厚度约为30nm。　　 2药物作用48h后，透射电镜可见5-FU组和5-FU/PEG-PBLG组细胞均呈凋亡改变：细胞质浓缩，胞核边缘化，染色质凝集、固缩。5-FU/PEG-PBLG组细胞胞浆内可见吞噬纳米微球的“吞噬泡”，而单纯的5-FU组未见吞噬泡。　　 3 MTT法检测可见5-FU组和5-FU/PEG-PBLG组均有明显的细胞毒作用。48h时5-FU组的细胞抑制率高于5-FU/PEG-PBLG组，但到了96h两组的抑制率则相差不大。随着时间的延长、药物浓度的增加，细胞生长抑制率逐渐增加。48h5-FU组和5-FU/PEG-PBLG组的IC50分别为2.82×10-5mol/L和7.08×10-5mol/L，96h5-FU组和5-FU/PEG-PBLG组的IC50分别为1.38×10-5mol/L和1.74×10-5mol/L。　　 4流式细胞仪检测发现在较高浓度(1×10-5mol/L)时，5-FU和5-FU/PEG-PBLG组随着时间的延长S期的比例逐渐增加，差异不大。较低浓度(1×10-6mol/L)时5-FU组S期的比例随时间延长下降比较明显，而5-FU/PEG-PBLG组下降不明显。　　 5肿瘤倍增时间以5-FU/PEG-PBLG组最大(19.55天)，其次是5-FU组(15.04天)，NS组和PEG-PBLG组分别为8.99天和10.14天。5-FU组、5-FU/PEG-PBLG组相对于NS组肿瘤抑制率分别为47.25％、53.70％。　　 6实验第1d肿瘤的平均体积为：231.95±64.44mm3，各组别间无明显的差异(P＞0.05)。第19天四个组肿瘤的体积两两比较，5-FU/PEG-PBLG组体积最小。　　 7组织病理学检查显示NS组、PEG-PBLG组肿瘤生长活跃，可见较多的瘤巨细胞、核分裂相多见，未见组织坏死或炎症细胞浸润；而5-FU组和5-FU/PEG-PBLG组可见肿瘤内有灶性坏死。NS组、PEG-PBLG组、5-FU组、5-FU/PEG-PBLG组的肝、肾、心、脾组织病理学检查均未见明显病理学改变。　　 8高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)检测药物体内分布显示：5-FU在肝、脾的分布均较5-FU/PEG-PBLG高，在肝脏的分布差异无统计学意义(P＞0.05)，脾脏的分布差异有统计学意义(P＜0.05)。肝脏分布的峰值时间两组相似，在脾脏分布峰值5-FU/PEG-PBLG组较5-FU组迟4小时。在瘤体中的分布5-FU/PEG-PBLG较5-FU组高，且持续时间延长4小时。　　 结论：　　 15-FU/PEG-PBLG纳米微球对Hep2细胞具有较强的抑制作用，对裸鼠移植瘤具有较好的抑瘤效果。　　 25-FU/PEG-PBLG纳米微球可以减少5-FU在肝脾的分布，增加在瘤体的浓度及作用时间。