论文部分内容阅读
目的:探讨 Lnc-ENST00000556926 对煤焦沥青提取物(coal tar pitch extracts,CTPE)诱导的恶性转化永生化人支气管上皮细胞株BEAS-2细胞的影响,为从长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,LncRNAs)的角度探讨恶性转化的机制提供理论依据。方法:1.采用2.4μg/mL CTPE对BEAS-2B细胞染毒72h,细胞传代后,按同样的染毒方式染毒4次,染毒结束后的细胞计为0代(CTPE0),之后细胞正常传代培养至30代(CTPE30),建立细胞恶性转化模型,采用2‰的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)作为对照组,采用 RT-PCR 检测Lnc-ENST00000556926 的表达量。2.采用UCSC数据库分析Lnc-ENST00000556926的基本信息;用Coding Potential Calculator 2(CPC2)和 Coding Potential Assessment Tool(CPAT)数据库分析Lnc-ENST00000556926的蛋白编码能力;采用细胞质核分离技术分析Lnc-ENST00000556926 的亚细胞定位。3.采用 100nM的siRNA干扰恶性转化的CTPE30组细胞中的Lnc-ENST00000556926,于 siRNA 作用 0h、12h、24h 和 36h 时,采用 RT-PCR检测 Lnc-ENST00000556926 的表达量。4.采用CCK-8法检测各组细胞的增殖能力;采用流式细胞仪检测各组细胞的周期变化和凋亡情况。5.采用Illumina平台对恶性转化的CTPE30组和CTPE30+siRNA组对照组的mRNAs进行测序,用DESeq2进行基因差异表达分析,用RT-PCR对筛选出的mRNAs进行验证。6.统计分析:采用SPSS 21.0统计软件对数据结果进行分析,实验数据均以均数±标准差((?)±s)表示,组间的比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD法分析和两组独立样本间比较采用t检验,检验水平为α=0.05。结果:1.Lnc-ENST00000556926在细胞恶性转化后的表达情况与对照组相比,Lnc-ENST00000556926在恶性转化的CPTE30组表达量明显升高(P<0.001)。2.Lnc-ENST00000556926的基本信息和蛋白编码能力预测及其亚细胞定位Lnc-ENST00000556926位于人类的第14号染色体长臂3区1带3亚带(chr14q31.3),有两个外显子和一个内含子。其长度为458bp,编码能力为不编码或编码能力弱。该LncRNA主要定位在细胞核中,少部分定位于细胞质中。3.Lnc-ENST00000556926的最佳干扰时间与对照组相比,在转染时间12h、24h和36h时,Lnc-ENST00000556926的相对表达量分别减少790.08倍、29.18倍和16.98倍(P<0.05)。因此,12h被确定为Lnc-ENST00000556926最佳的干扰时间。4.Lnc-ENST00000556926干扰对细胞功能的影响与恶性转化的CTPE30组和CTPE 30+NC组相比,CTPE 30+siRNA组的增殖能力减弱,且差异具有统计学意义(P<0.05);与CTPE30+siRNA组相比,恶性转化的CTPE 30组和CTPE 30+NC组在G0/G1期细胞明显减少,在G2期的细胞比例明显增加,且差异具有统计学意义(P<0.05);与恶性转化的CTPE30和CTPE 30+NC组相比,CTPE 30+siRNA组的凋亡率明显升高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。5.筛选Lnc-ENST00000556926的相关基因及RT-PCR验证结果以Fold change≥1.5和P<0.05为筛选标准,得到159个差异表达的mRNAs,其中表达上调的有62条mRNAs,表达下调的有97条mRNAs。与恶性转化的CTPE30组相比,CTPE30+siRNA组中的TXNDC5与FOXD1表达下调,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:Lnc-ENST00000556926参与调节CTPE所致恶性转化的BEAS-2B细胞的增殖、周期和凋亡,其可能与基因TXNDC5和FOXD1之间存在调控关系。