【摘 要】
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Micro RNAs（miRNAs）为长约18～25nt的内源性非编码RNA,在卵巢中参与细胞增殖凋亡、类固醇激素生成与分泌等生理过程。课题组前期研究发现miR-27b-3p在鹅卵泡颗粒层中表达量很高,并且随着卵泡发育逐渐升高,推测miR-27b-3p可能在调控卵泡颗粒细胞功能方面具有重要作用。因此,本研究以鹅颗粒细胞为试验材料,探究miR-27b-3p在颗粒细胞类固醇分泌方面的作用及其调控机制,
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（31672424）； 国家现代水禽产业体系项目（CARS-42-4）；
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Micro RNAs（miRNAs）为长约18～25nt的内源性非编码RNA,在卵巢中参与细胞增殖凋亡、类固醇激素生成与分泌等生理过程。课题组前期研究发现miR-27b-3p在鹅卵泡颗粒层中表达量很高,并且随着卵泡发育逐渐升高,推测miR-27b-3p可能在调控卵泡颗粒细胞功能方面具有重要作用。因此,本研究以鹅颗粒细胞为试验材料,探究miR-27b-3p在颗粒细胞类固醇分泌方面的作用及其调控机制,主要结果如下:（1）定量PCR表明,miR-27b-3p表达量在等级前卵泡颗粒层中先下降后上升,在等级阶段则先上升后下降,其中在4～6 mm阶段表达量最低,F4阶段表达量最高,miR-27b-3p在等级卵泡颗粒层表达量高于等级前卵泡。（2）通过转染不同浓度的miR-27b-3p mimic和inhibitor,筛选出90 nmol/L和150 nmol/L的处理浓度。MTT实验结果表明,miR-27b-3p对颗粒细胞活性没有显著影响（P>0.05）。ELISA实验结果表明,过表达miR-27b-3p后孕酮和雌二醇分泌量显著减少（P<0.05）,抑制miR-27b-3p后雌二醇分泌量显著升高（P<0.05）,孕酮分泌量变化不显著（P>0.05）。（3）对miR-27b-3p已验证的靶基因集合和多个网站预测到的靶基因集合取并集,KEGG通路富集后发现miR-27b-3p的靶基因主要富集到AMPK信号通路、Fox O信号通路和TGF-β信号通路等,其中,CYP1B1可能通过AMPK信号通路调控类固醇激素分泌。（4）双荧光素酶报告载体实验发现,miR-27b-3p mimic可以显著抑制CYP1B1野生型载体的荧光素酶活性（P<0.05）,但对CYP1B1突变型载体荧光素酶活性无影响（P>0.05）。抑制miR-27b-3p表达后,CYP1B1表达量显著升高（P<0.05）,说明miR-27b-3p通过靶向CYP1B1 3′UTR调控其表达量。（5）在鹅颗粒细胞中转染1μg载体或80 nmol/L si-542过表达或抑制CYP1B1的表达量发现,抑制CYP1B1后显著减少孕酮分泌（P<0.05）,但不影响雌二醇分泌,AMPKα表达量显著降低,AMPK信号通路上游关键基因CAMKK2和TAK1表达量显著升高（P<0.05）,LKB1表达量显著下降（P<0.05）;过表达CYP1B1则显著降低雌二醇分泌量（P<0.05）,对孕酮分泌无影响,LKB1和TAK1表达量显著下降（P<0.05）,表明CYP1B1可能通过AMPK信号通路调控鹅颗粒细胞类固醇激素分泌。综上,miR-27b-3p通过靶向CYP1B1影响AMPK信号通路来调控鹅颗粒细胞类固醇激素分泌,为进一步探究miR-27b-3p在禽类颗粒细胞中的功能奠定基础。
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