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本研究分别以成年绵羊皮肤成纤维细胞和胎儿皮肤成纤维细胞为核供体,绵羊卵胞为核受体构建重构胚,并比较了两种重构胚的融合率、卵裂率和桑椹胚率。在37℃、5%CO2、饱和湿度下,DMEM-F12+1O%FBS培养液适宜于绵羊皮肤成纤维体外生长。组织块培养法对于原代细胞的培养要优于酶消化法。传代培养时,酶化法和反复贴壁法可分离纯化绵羊皮肤成纤维细胞,以D-Hanks为缓冲液配制的胰白酶适合绵羊皮肤成纤维细胞的消化。成年绵羊皮肤成纤维细胞较胎儿皮肤成纤维细胞生长缓慢,群体倍增时间分别为48h和24h;并发现至少在传至第1O代时有80.0%的染色体还保持正常的倍数(2n=54)。
用离子霉素联合6-DMAP能有效地激活绵羊卵母细胞,其囊胚率为30.4%,高于细胞松弛素B法的27.4%;电场强度为1500v/cm,脉冲时间为40μsec较适合重构胚的融合。采用盲吸法去核,保证卵母细胞成熟率的条件下,体外成熟18~21h比较适宜。
成年皮肤成纤维细胞-卵母细胞重构胚,其融合率、卵裂率、桑椹胚率分别为76.O%、76.2%、26.9%;胎儿皮肤成纤维细胞-卵母细胞重构胚,其融合率、卵裂率、桑椹胚率分别为75.5%、79.5%、28.3%,分别以成年和胎儿皮肤成纤维细胞为核供体对重构胚的发育无显著影响(P>0.05)。