非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）是具有与酒精性脂肪性肝病相同病理改变而无过量饮酒史的临床病理综合症。NAFLD疾病谱包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis， NASH)、非酒精性脂肪性肝纤维化和NASH相关肝硬化，其中非酒精性脂肪性肝炎/肝纤维化是该病进展的关键环节和发展为肝硬化的必经阶段。迄今，关于该病发生及进展的机制尚不十分清楚，亦缺乏有效的治疗措施。　　 血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1， HO-1）是一种抗氧化酶，主要功能是催化血红素产生等摩尔的胆绿素/胆红素、一氧化碳和游离铁，具有抗氧化、抗炎、抑制细胞增生、改善微循环等生物学作用，但其在非酒精性脂肪性肝炎/肝纤维化中的作用及作用机制尚不清楚。　　 本课题采用高脂、胆碱-蛋氨酸缺乏(high fat， methionine-choline deficient diet， MCD)饮食建立非酒精性脂肪性肝炎/肝纤维化动物模型，观察HO-1表达与肝脂肪变、炎症及纤维化发生发展的关系，并探讨HO-1靶向调控的治疗作用及作用机制，为该病治疗策略的选择及药物的开发提供科学依据。　　 第一部分、非酒精性脂肪性肝炎/肝纤维化动物模型的建立及HO-1表达的研究　　 目的：探讨HO-1在非酒精性脂肪性肝炎/肝纤维化发病过程中的表达、作用及作用机制。　　 方法：采用MCD饮食喂养健康雄性C57BL/6J小鼠4周、8周，分别建立非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝纤维化模型，以胆碱-蛋氨酸充足饮食设立对照组。酶法测定血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase， ALT)及天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase， AST)水平；HE、苏丹Ⅳ和Masson染色观察肝脂肪变、炎症活动和纤维化程度，肝脂肪变、炎症及纤维化程度的评估依据2010年中华医学会脂肪肝学组《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》及美国NASH临床研究协会病理工作组2005年制定的NAFLD组织学评分(NAFLD activity score， NAS)系统；以实时定量PCR、Western blot和免疫组织化学染色检测HO-1 mRNA及蛋白表达。　　 结果：　　 1.实验小鼠血清ALT、AST水平：　　 MCD饮食喂养4周及8周后，模型组小鼠的血清ALT(267.03±31.50U/L、695.87±73.96U/L)和AST(517.43±20.84U/L、986.93±23.69U/L)水平较对照组ALT（31.43±4.76U/L、32.43±13.54U/L）和AST（34.73±6.16U/L、33.20±14.00U/L）水平显著升高，差异有统计学意义，P＜0.001。　　 2.实验小鼠肝脏解剖学及组织病理学变化：　　 2.1 大体观察　　 对照组小鼠肝脏大小正常、被膜光滑，为暗红色，明亮有光泽；模型组小鼠4周时即出现肝脏体积减小，颜色变黄，有油腻感；8周时肝脏减小明显、黄色油腻感更加明显、无光泽，边缘圆钝，与周围组织有粘连。　　 2.2 光镜下观察　　 HE及Masson染色：对照组肝小叶结构基本正常；MCD饮食4周，肝细胞弥漫性水样变，伴有大泡性为主的肝细胞脂肪变，以腺泡3带为著，肝窦间隙变窄，小叶内可见点状或灶状肝细胞坏死，伴有淋巴细胞和少量中性粒细胞浸润（NAS评分6～7S1）；MCD饮食8周，小鼠肝脂肪变、肝细胞坏死、炎性细胞浸润加重，窦周细胞增生活跃，汇管区扩大，纤维组织增生，可见纤维间隔形成(NAS评分7～8S1～2)。苏丹Ⅳ染色：对照组肝细胞胞浆偶见脂肪小滴；模型组，MCD饮食4周肝细胞脂肪变明显，胞浆充满鲜红色脂滴，8周较4周肝细胞脂肪变加重。　　 3.实验小鼠肝组织HO-1 mRNA及蛋白表达及其在肝损伤中的作用：　　 3.1 HO-1 mRNA表达实时定量PCR检测。实验小鼠喂养4周和8周，对照组肝组织HO-1 mRNA少量表达（0.86±0.12和0.79±0.20）：模型组4周和8周HO-1 mRNA表达（5.49±1.26和4.66±0.67）均较对照组显著升高，差异具有统计学意义，P＜0.01。　　 3.2 HO-1蛋白表达Western blot检测。实验小鼠肝组织HO-1蛋白表达与mRNA表达呈一致趋势，模型组4周和8周（0.66±0.05、0.53±0.08）较对照组（0.22±0.03、0.26±0.09）显著增强，差异具有统计学意义，P＜0.01；肝组织切片免疫组织化学染色显示，造模4周和8周，对照组肝组织中偶见HO-1在Kupffer细胞中表达，阳性细胞百分比分别为：0.09±0.01和0.04±0.00；模型组为1.13±0.18和0.91±0.15，主要表达在Kupffer细胞、肝星状细胞和肝细胞的胞浆中，两组间差异显著，P＜0.01。　　 结论：　　 1.高脂、胆碱-蛋氨酸缺乏饮食可诱导与人类非酒精性脂肪性肝炎/肝纤维化比拟性良好的动物模型，为发病机制和治疗药物的研究提供了良好的实验模型。　　 2.非酒精性脂肪性肝炎/肝纤维化组织中HO-1 mRNA及蛋白表达明显上调，可能为一种对氧化性肝损伤的反应性保护作用，表明HO-1参与非酒精性脂肪性肝炎/肝纤维化的发病及进展。　　 第二部分、HO-1基因调控对非酒精性脂肪性肝炎中肝细胞凋亡的影响　　 目的：探讨HO-1对非酒精性脂肪性肝炎发病及进展中肝细胞凋亡的影响及机制。　　 方法：采用MCD饮食喂养C57BL/6J小鼠4周，建立NASH模型。分别应用HO-1抑制剂锌原卟啉(ZnPP-IX)、激动剂血晶素(hemin)及/或腺病毒载体HO-1基因导入(Ad-HO-1)进行干预实验，设立对照组及空载体Ad-GFP导入组。酶法测定血清ALT和AST水平；光镜下观察肝脂肪变及炎症程度：硫代巴比妥酸法测定肝组织丙二醛(malondialdehyde， MDA)含量；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotide transferase mediated dUTP nick end labeling method, TUNEL)检测肝细胞凋亡的形态特征和分布，并计算细胞凋亡指数；免疫组织化学染色、实时定量PCR和Western blot法检测HO-1的分布及表达；实时定量PCR和Western blot法检测凋亡相关因子mRNA及蛋白的表达。　　 结果：　　 1.实验小鼠血清ALT及AST水平：　　 对照组、模型组及Ad-GFP导入组ALT和AST依次为：31.43±4.76U/L和34.73±6.16U/L、267.03±31.50U/L和268.27±30.44U/L、517.43±20.84U/L和509.73±16.57U/L，模型组和Ad-GFP导入组显著高于对照组；HO-1激动剂血晶素组为109.16±16.49U/L和235.38±14.37U/L，显著低于模型组；HO-1抑制剂锌原卟啉组ALT和AST为499.74±14.09U/L和75.12±63.89U/L，显著高于模型组：HO-1腺病毒Ad-HO-1导入组和血晶素与Ad-HO-1联合组血清ALT(110.12±9.12U/L、103.24±6.07U/L)和AST（211.34±19.86U/L、205.86±13.37U/L）均较Ad-GFP导入组显著降低；血晶素组、Ad-HO-1导入组及血晶素与Ad-HO-1联合应用组三者间血清ALT、AST水平无明显差异。　　 2.实验小鼠组织病理学变化：　　 肝组织切片HE染色显示，模型组、Ad-GFP导入组可见中、重度脂肪变及明显的炎性细胞浸润（NAS评分6～7S1），肝损伤表现同第一部分。血晶素组、Ad-HO-1导入组、血晶素与Ad-HO-1联合应用组小鼠肝损伤较模型组明显减轻，肝细胞轻度水样变，脂肪变轻微，未见明显肝细胞坏死及炎性细胞浸润(NAS评分2～3S0)，血晶素和Ad-HO-1联合应用组未见明显的协同作用；锌原卟啉干预组较MCD模型组肝细胞重度脂肪变性、炎细胞浸润更加明显(NAS评分7～8S1～2)。　　 3.实验小鼠肝细胞的凋亡情况：　　 TUNEL分析结果显示，对照组肝细胞凋亡偶见(0.43±0.25％)；与对照组相比，MCD模型组及Ad-GFP导入组TUNEL阳性细胞数（3.59±1.02％、4.17±1.04％）明显增多；与模型组比较，血晶素组TUNEL阳性细胞数（1.63±0.78％）明显减少，而锌原卟啉组TUNEL阳性细胞数（6.38±0.80％）显著增多，与肝组织损伤程度相一致；Ad-HO-1导入组和血晶素与Ad-HO-1联合应用组TUNEL阳性细胞数(1.53±0.45％、1.33±0.53％)较Ad-GFP导入组明显减少，但血晶素组、Ad-HO-1导入组和血晶素与Ad-HO-1联合应用组三者间TUNEL阳性细胞数无明显差异。　　 4.实验小鼠肝组织中MDA含量的变化：　　 MCD模型组及Ad-GFP导入组肝组织MDA含量（5.09±1.01nmol/mg、4.95±0.75nmol/mg）较对照组（1.68±0.32nmol/mg）明显升高；与模型组比较，血晶素组肝组织MDA含量（3.50±0.67nmol/mg）明显降低，而锌原卟啉组MDA含量（6.44±0.65nmol/mg）升高显著；Ad-HO-1导入组和血晶素与Ad-HO-1联合应用组MDA含量（3.69±0.78nmol/mg、3.13±0.66nmol/mg）较Ad-GFP导入组明显降低，但血晶素组、Ad-HO-1导入组和血晶素与Ad-HO-1联合应用组三者间MDA含量无明显差异。　　 5.实验小鼠肝组织中HO-1表达情况：　　 实时定量PCR和Western blot法检测显示HO-1 mRNA及蛋白的表达呈一致趋势，MCD模型组及Ad-GFP导入组显著高于对照组，P＜0.01，P＜0.001；血晶素组、Ad-HO-1导入组及血晶素与Ad-HO-1联合应用组显著高于模型组，P＜0.01，P＜0.001;锌原卟啉组HO-1表达明显减少。肝组织切片免疫组化染色结果显示，HO-1表达与上述结果呈一致趋势，主要表达于Kupffer细胞、肝星状细胞和肝细胞浆内。　　 6.HO-1基因调控对实验小鼠肝组织CYP2E1、Fas、FasL、caspase-3、caspase-9、Cyt-c、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表达的影响：　　 与对照组比较，MCD模型组和Ad-GFP导入组肝组织CYP2E1、Fas、FasL、caspase-3、caspase-9、Cyt-c和Bax mRNA及蛋白表达明显升高；与模型组对比，血晶素组肝组织CYP2E1、Fas、FasL、caspase-3、caspase-9、Cyt-c和Bax mRNA及蛋白表达显著下降，而锌原卟啉组CYP2E1、Fas、FasL、caspase-3、caspase-9、Cyt-c和Bax mRNA及蛋白表达进一步升高；与Ad-GFP导入组比较，Ad-HO-1导入组和血晶素与Ad-HO-1联合应用组CYP2E1、Fas、FasL、caspase-3、caspase-9、Cyt-c和Bax mRNA及蛋白表达显著下降；Bcl-2 mRNA及蛋白在各组小鼠肝组织中的表达与上述因子的表达趋势相反。但血晶素组、Ad-HO-1导入组及血晶素与Ad-HO-1联合应用组三者间CYP2E1、Fas、FasL、caspase-3、caspase-9、Cyt-c、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表达无明显差异。　　 结论：　　 1.在MCD饮食诱导的NASH模型中，氧化应激可能是肝细胞发生凋亡的始动因素。　　 2.血晶素和Ad-HO-1基因导入上调HO-1表达，阻止或减轻氧化应激导致的肝损伤。　　 3.HO-1基因表达上调可通过抑制氧化应激反应和调节凋亡相关基因的表达阻止肝细胞凋亡的发生，从而减缓或阻止非酒精性脂肪性肝炎的进展。　　 第三部分、HO-1基因调控对非酒精性脂肪性肝纤维化小鼠纤维化相关因子表达的影响　　 目的：探讨HO-1基因调控在非酒精性脂肪性肝纤维化进展中的作用及其机制。　　 方法：采用MCD饮食喂养C57BL/6J小鼠8周，建立非酒精性脂肪性肝纤维化模型，实验分组及干预方式同第二部分。酶法测定小鼠血清ALT和AST水平；光镜下观察肝脂肪变、炎症活动及纤维化程度；羟脯氨酸分析法测定肝脏胶原含量；硫代巴比妥酸法测定肝组织MDA含量；RT-PCR和实时定量PCR测定肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha， TNF-α)、白细胞介素-6（interleukin-6， IL-6）和细胞信号传导抑制因子-1（suppressor of cytokine signaling-1， SOCS-1）mRNA表达；实时定量PCR和Western blot法检测HO-1、α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin， a-SMA)、转化生长因子β1(transforming growth factor beta1， TGF-β1)、基质金属蛋白酶-2(matrix metallopeptidase2)、基质金属蛋白-9（matrix metallopeptidase-9）mRNA和蛋白表达。　　 结果：　　 1.实验小鼠血清ALT及AST水平：　　 对照组、模型组和Ad-GFP导入组ALT和AST依次为：32.43±13.54U/L和33.20±24.00U/L、695.87±73.96U/L和986.93±23.70U/L、643.93±45.01U/L和918.90±127.74U/L，模型组和Ad-GFP导入组显著高于对照组；HO-1激动剂血晶素组ALT和AST为234.28±35.36U/L和308.80±29.20U/L，显著低于模型组；HO-1抑制剂锌原卟啉组ALT和AST为983.50±28.72U/L和1122.52±64.54U/L，显著高于模型组；与Ad-GFP导入组相比，HO-1腺病毒Ad-HO-1导入组和血晶素与Ad-HO-1联合应用组血清ALT(229.96±38.86U/L、219.80±26.06U/L)、AST(291.00±20.53U/L、267.07±36.42U/L)均较Ad-GFP导入组显著降低；血晶素组、Ad-HO-1导入组及血晶素与Ad-HO-1联合应用组三者间血清ALT、AST水平无明显差异。　　 2.实验小鼠肝组织病理学变化：　　 肝组织切片HE及Masson染色显示，模型组、Ad-GFP导入组肝细胞脂变、点灶状坏死明显，窦周细胞增生活跃，可见炎细胞浸润，汇管区扩大，纤维组织增生，纤维间隔形成(NAS评分7～8S1～2)；血晶素组、Ad-HO-1导入组、血晶素与Ad-HO-1联合应用组小鼠肝组织病变较模型组明显减轻，少数肝细胞脂肪变，个别气球样变，偶见小叶内点、灶状坏死，轻度纤维组织增生，汇管区扩大不明显(NAS评分3～4S0～1)，血晶素与Ad-HO-1联合应用组未见明显的协同作用；锌原卟啉组肝细胞重度脂肪变性，炎细胞浸润、窦周纤维化明显(NAS评分7～8S2～3)。　　 3.HO-1调控对实验小鼠肝组织中羟脯氨酸含量的影响：　　 造模8周，MCD模型组和Ad-GFP导入组肝组织羟脯氨酸含量(196.67±21.93μg/mg、316.67±44.01μg/mg）均显著高于对照组（196.67±21.93μg/mg）；与模型组比较，血晶素组肝组织羟脯氨酸含量（263.00±14.73μg/mg）明显降低，而锌原卟啉组肝组织羟脯氨酸含量（446.00±24.42μg/mg）显著增高；与Ad-GFP导入组对比，Ad-HO-1导入组和血晶素与Ad-HO-1联合应用组肝组织羟脯氨酸含量亦明显降低（271.67±13.32μg/mg、258.67±20.21μg/mg）；血晶素组、Ad-HO-1导入组及血晶素与Ad-HO-1联合应用组三者间肝组织羟脯氨酸含量无明显差异。　　 4.HO-1调控对实验小鼠肝组织中MDA含量的影响：　　 造模8周，与对照组（1.49±0.40nmol/mg）比较，MCD模型组及Ad-GFP导入组肝组织MDA含量（4.81±0.98nmol/mg、4.63±0.92nmol/mg）明显升高；与模型组相比，血晶素组肝组织MDA含量（3.57±0.63nmol/mg）明显降低，而锌原卟啉组MDA含量（6.29±0.69nmol/mg）升高显著；与Ad-GFP导入组相比，Ad-HO-1导入组和血晶素与Ad-HO-1联合应用组MDA含量（3.43±0.49nmol/mg、3.00±0.40nmol/mg）亦明显降低，但血晶素组、Ad-HO-1导入组和血晶素与Ad-HO-1联合应用组三者间MDA含量无明显差异。　　 5.实验小鼠肝组织HO-1 mRNA及蛋白的表达：　　 各组实验小鼠HO-1表达趋势同第二部分。　　 6.HO-1调控对实验小鼠肝组织炎症因子TNF-α、IL-6和SOCS-1 mRNA表达的影响：　　 MCD模型组及Ad-GFP导入组肝组织TNF-α、IL-6和SOCS-1 mRNA表达较对照组明显升高；与模型组比较，血晶素组肝组织TNF-α、IL-6和SOCS-1 mRNA表达显著下降，而锌原卟啉组TNF-α、IL-6和SOCS-1 mRNA表达进一步升高；与Ad-GFP导入组比较，Ad-HO-1导入组和血晶素与Ad-HO-1联合应用组TNF-α、IL-6和SOCS-1 mRNA表达显著下降，而血晶素组、Ad-HO-1导入组和血晶素与Ad-HO-1联合应用组三者间TNF-α、IL-6和SOCS-1 mRNA表达无明显差异。　　 7.HO-1调控对实验小鼠肝组织纤维化相关因子α-SMA、TGF-β1、MMP-2和MMP-9 mRNA及蛋白表达的影响：　　 MCD模型组及Ad-GFP导入组肝组织α-SMA、TGF-β1、MMP-2和MMP-9 mRNA表达较对照组明显升高；与模型组比较，血晶素组肝组织α-SMA、TGF-β1、MMP-2和MMP-9 mRNA表达显著下降，而锌原卟啉组α-SMA、TGF-β1、MMP-2和MMP-9 mRNA表达进一步升高；与Ad-GFP导入组对比，Ad-HO-1导入组和血晶素与Ad-HO-1联合应用组α-SMA、TGF-β1、MMP-2和MMP-9 mRNA表达显著下降，而血晶素组、Ad-HO-1导入组和血晶素与Ad-HO-1联合应用组三者间α-SMA、TGF-β1、MMP-2和MMP-9 mRNA表达无明显差异。　　 结论：　　 1.HO-1表达上调可显著抑制氧化应激反应、减轻肝脏炎症、抑制肝星状细胞的活化及促纤维相关基因的表达。　　 2.HO-1靶向基因调控可能为治疗非酒精性脂肪性肝纤维化的有效策略之一。