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背景与目的:脊髓损伤往往会引起神经元结构和功能发生不可逆的损害,导致神经功能被破坏,感觉和运动能力部分或全部丧失,甚至截瘫或四肢瘫痪[1]。脊髓损伤按照病理进程一般分为原发性脊髓损伤和继发性脊髓损伤。原发性脊髓损伤往往是由外因或内因直接作用于脊髓引起的机械损伤,一经出现则无法挽回。急性脊髓损伤后,由炎症反应、自由基诱导的氧化损伤等介导的瀑布放大式组织自毁级联反应称为继发性损伤,会导致损伤区域扩大使瘫痪扩展到更高节段,其损毁度远远大于原发性脊髓损伤。当前,针对脊髓损伤的治疗药物主要有甲基泼尼松龙、神经节苷酯等,但这些临床药物用存在药时间长、长期疗效不显著、缺乏安全性、患者依从性差等弊端,寻找安全高效的药物已尤为迫切[2]。课题组前期研究发现,广西道地药材广山楂的主要成分山楂叶总黄酮能够明显降低脊髓损伤大鼠受损段脊髓中炎性因子的表达,减少大鼠脊髓组织中炎性细胞的浸润,减轻神经细胞内质网的肿胀,降低脊髓空洞率[3-4]。而从体外层面探讨山楂叶总黄酮对受损脊髓神经元修复的研究国内外几乎没有。而脊髓损伤后,星型胶质细胞被大量激活并调控脊髓神经元的微环境,在调控脊髓神经的修复与再生过程中扮演着重要的角色[5]。因此,本实验通过体外实验探讨山楂叶总黄酮联合星型胶质细胞调控受损脊髓神经元的微环境、促进脊髓神经元修复的分子机制。方法:1.解剖新生大鼠分离脊髓神经元并利用不含血清Neurosouls培养基进行培养,并用β-Tubulin3免疫荧光染色对脊髓神经元进行鉴定。2.取体外培养7d的脊髓神经元,用不同浓度的过氧化氢干预不同时间,MTT检测脊髓神经元的存活率,从而构建合适的脊髓神经元氧化损伤模型。3.通过MTT法评估山楂叶总黄酮对脊髓神经元和星型胶质细胞的毒性。4.通过Transwell小室构建脊髓神经元与星型胶质细胞的共培养模型,将脊髓神经元分为5组,Con组（脊髓神经元不经过任何处理）;Hurt组（200μM H2O2处理脊髓神经元24h）;Astrocyte组（脊髓神经元加入H2O2处理24h后,通过transwell小室与AS建立共培养）;Direct drug组（脊髓神经元经H2O2处理24h后,加入125μg/m L的TFHL处理24h）;Co-culture组（脊髓神经元加入H2O2处理24h后,通过transwell小室与AS建立共培养,同时加入125μg/m L的TFHL处理24h）。5.MTT检测不同处理方式下脊髓神经元的活性。6.倒置相差显微镜观察不同处理方式下脊髓神经元的形态变化。7.免疫荧光染色观察不同处理方式下脊髓神经元的变化。8.电镜检测不同处理方式下脊髓神经元的自噬囊泡变化。9.ROS试剂盒检测不同处理方式下脊髓神经元的活性氧变化。10.MDC试剂盒检测不同处理方式下脊髓神经元的自噬体形成的情况。11.免疫印迹和PCR检测不同处理方式下星型胶质细胞的炎性因子和炎性通路NF-k B上的信号分子的表达变化。结果:1.免疫荧光染色发现,脊髓神经元细胞阳性率﹥90%,体外神经元分离培养成功。2.MTT检测发现,当H2O2浓度小于等于100μM时对细胞没有明显毒性作用,但随浓度的增大（>400μM）,细胞活性明显下降。浓度为200μM的H2O2作用24h带来的氧化应激损伤效果明显优于12h,所以本实验以浓度为200μM的H2O2处理脊髓神经元24h为理想模型条件。3.MTT细胞毒性实验发现,山楂叶总黄酮的剂量浓度只要小于125μg/ml这个剂量就不会对脊髓神经元产生细胞毒性作用。4.与Hurt组相比,Co-culture组细胞存活率为68.21%,明显高于Hurt组。5.形态学观察发现,Hurt组脊髓神经元胞体皱缩,突起消失,细胞大量死亡。Co-culture组较Hurt组脊髓神经元数量明显增加,形态完整,突起较多。6.免疫荧光发现,与Hurt组相比,Co-culture组细胞骨架完整,微管蛋白Map-2含量明显增高。7.MDC染色发现,对比Hurt组,Co-culture组细胞自噬囊泡数量明显增加。8.ROS染色发现,与Hurt组相比,Co-culture组活性氧的含量明显减少。9.电镜观察发现,与Hurt组相比,Co-culture组自噬小体数量明显增多。10.PCR发现,对比Hurt组,Drug组促炎细胞因子的m RNA表达明显降低,抑炎细胞因子的m RNA表达明显增加。11.WB结果同样证实了对比Hurt组,Drug组促炎细胞因子的蛋白表达明显降低,抑炎细胞因子的蛋白表达明显增加。12.对比Hurt组,Drug组信号通路蛋白的表达水平明显降低。结论:1.山楂叶总黄酮能够联合星型胶质细胞促进氧化损伤的脊髓神经元修复。2.山楂叶总黄酮能够抑制星型胶质细胞NF-κB信号通路蛋白的表达水平,抑制炎性细胞因子的表达,改善脊髓神经元的微环境,从而抑制脊髓神经元的氧化损伤,最终达到促进脊髓神经元的自噬和修复。3.山楂叶总黄酮可能成为一种潜在的新的治疗继发性脊髓损伤的药物,并可能用于脊髓损伤后的营养干预治疗。