研究背景与目的大肠癌的发生率逐年上升,近年大肠癌已成为发达国家和地区导致死亡的主要疾病之一。根据癌变发生机理的不同,将大肠癌分为两类:一类称为染色体不稳定性大肠癌(CIN),它涵盖了80%以上的散发性大肠癌,其发生的始动因素主要是APC基因缺陷,经过多阶段、多基因突变而致癌;另一类称为微卫星不稳定(MSI)性大肠癌,它涵盖了遗传性非息肉病性大肠癌(HNPCC)和10%-15%散发性大肠癌,其发生主要是错配修复(MMR)基因缺陷导致MSI,引起大肠癌,因此又称为MSI性大肠癌。HNPCC是一种单基因显性遗传性疾病,占所有结直肠癌的5%-15%,外显率达80%-90%,多见于青年患者。临床特点主要为发病年龄早、好发于近端结肠,常伴发肠外肿瘤,尤其是子宫内膜癌、胃癌、小肠癌、前列腺癌及肝癌、泌尿系统肿瘤等。由于该肿瘤无明显形态学特征及特异的生化指标,家系调查和年青发病不足以建立最终诊断,因此证实MMR基因的种系突变是目前诊断HNPCC的金标准。已知与发生相关的基因包括hMLH1、hMSH2、hPMS1、hPMS2、hMSH3和hMSH6等,90%以上的突变发生于hMLH1和hMSH2。微卫星分析和免疫组织化学(IHC)染色常用于HNPCC最初的诊断性筛查。由于突变分布于整个MMR基因,并无突变热点。变性高效液相色谱技术(DHPLC)具有敏感、高效、经济的特点,是目前大规模筛查未知突变的一种实用方法。因此,本研究在前期研究的基础上,对新收集的504例大肠癌和95例子宫内膜癌进行调查分析,选择一组可疑HNPCC和HNPCC相关子宫内膜癌(均≤50岁)病例进行免疫组化检测,同时对新近收集的可疑HNPCC(≤50岁)新鲜组织标本进行微卫星分析,筛查高度可疑患者,然后通过DHPLC和基因测序分析确定突变位点并确定HNPCC患者。方法1.收集504例大肠癌病例,从性别、年龄、肿瘤好发部位、组织学类型及家族遗传史等方面进行分析,并探讨青年大肠癌的临床及病理特点。2.运用IHC检测可疑HNPCC及HNPCC相关的子宫内膜癌hMLH1和hMSH2蛋白表达情况,将蛋白表达异常的病例确定为高度可疑HNPCC病例。3.运用DHPLC在非变性条件下检测可疑HNPCC的微卫星情况,将MSI-H的病例确定为高度可疑HNPCC病例。4.运用DHPLC在部分变性条件下检测hMLH1和hMSH2基因突变:PCR扩增待测DNA片段,DHPLC对PCR产物进行检测,确定突变的基因片段。5.DNA测序:对DHPLC预测突变的DNA片段进行测序,确定突变种类,分析基因功能改变。结果1.504例大肠癌中位年龄为60岁,其中青年大肠癌(年龄≤40岁)75例,占14.88%。发病部位分别位于直肠226(44.84%)例;左半结肠130(25.79%)例,其中乙状结肠108(21.43%)例,降结肠18(3.57%)例,结肠脾曲4(0.79%)例;右半结肠130(25.79%)例,其中升结肠77(15.28%)例,横结肠30(5.95%)例,结肠肝曲8(1.59%)例,盲肠15(2.98%)例;其他18例(3.57%);其中单病灶486例,多发病灶18例。组织学分型为:腺癌496例(98.41%),其中高分化腺癌109例(21.63%),中分化腺癌275例(54.56%),低分化腺癌38例(7.54%),黏液腺癌74例(14.68%);其他类型8例(1.59%)。青年大肠癌分化不良者占49.33%,而中老年大肠癌分化不良者只占19.35%,二者差异有统计学意义。Dukes分期,进展期癌(B、C、D期)共455例,占90.28%。504例大肠癌患者中有家族遗传史的为33例(6.55%),其中13例为家族性腺瘤性息肉病(FAP);8例为符合Amsterdam标准Ⅱ的HNPCC,8个HNPCC家系总发病人数为31例,其中结直肠癌患者为25例,肠外肿瘤6例(子宫内膜癌1例、肺癌2例、肝癌1例、胰腺癌1例、鼻咽癌1例);另外12例患者家庭成员中只有2例患结直肠癌或相关肿瘤,为高度可疑HNPCC患者。2.为了实验的可行和结果的可靠,从504例大肠癌中选取157例可疑HNPCC(≤50岁)为筛查对象,30例老年大肠癌(＞50岁)为对照;另选取65例HNPCC相关的子宫内膜癌(≤50岁)为筛查对象,30例老年子宫内膜癌(＞50岁)为对照;运用IHC方法对hMLH1和hMSH2蛋白表达进行分析。157例可疑HNPCC的hMLH1/hMSH2蛋白表达异常的总检出率为31.85%(50/157):不同年龄段hMLH1/hMSH2表达异常检出率依次:≤30岁为28.57%(2/7)、31-40岁为30.43%(21/69)、41-50岁为33.33%(27/81);有家族史的病例hMLH1/hMSH2表达异常的总检出率为70.59%(12/17);hMLH1/hMSH2蛋白在右半结肠、左半结肠和直肠表达异常的检出率分别为53.85%(21/39)、28.89%(13/45)和21.92%(16/73);男性患者hMLH1/hMSH2表达异常的检出率为32.58%(29/89),女性患者为30.88%(21/68);对照组30例老年大肠癌hMLH1/hMSH2表达异常的检出率为6.67%(2/30)。65例HNPCC相关的子宫内膜癌hMLH1/hMSH2蛋白表达异常的总检出率为30.77%(20/65);不同年龄段hMLH1/hMSH2表达异常的检出率依次:≤30岁为0%(0/2),31-40岁为37.5%(9/24),41-50岁为28.21%(11/39);对照组30例老年子宫内膜癌hMLH1/hMSH2表达异常的检出率为6.67%(2/30)。3.为了获得MSI-H在可疑HNPCC病例中的发生情况,我们选取可行PCR扩增的71例可疑HNPCC为筛查对象,40例老年大肠癌作为对照,应用DHPLC在非变性的条件下检测微卫星情况。71例可疑HNPCC中,检出43例MSI-H怖?检出率为60.56%(43/71);各年龄段的检出率分别为:≤30岁:66.67%(4/6);31-40岁:62.16%(23/37);41-50岁:57.14%(16/28);40例老年大肠癌MSI-H的检出率为37.5%(15/40)。为了比较和分析IHC和MSI两种方法的优劣,对其中52例可疑HNPCC同时进行IHC和MS1分析,两种方法分析检出均为阳性的病例16例,二者均为阴性的病例24例。两种方法比较,高度可疑HNPCC的检出率相似。4.根据IHC和MSI分析结果,从中选取20例高度可疑HNPCC进行DHPLC检测,hMLH1出现杂合双峰的有5例,其中Exon1有2例,Exon8有2例,Exon15有1例;hMSH2出现杂合双峰的有8例,其中Exon1有3例,Exon 9有1例,Exon13有3例,Exon16B有1例;DHPLC杂合双峰的检出率为65.00%(13/20)。经DNA测序和序列比对,发现了9个突变,其中新突变3个(Intron151731+15delT;hMSH2 Exon 13 2196T＞C和Exon 16 2963C＞G);已知突变6个(hMSH2 Intronl 218+8C＞GExon 9 1452-1455delAATG和Intron 132006-5A＞G),包括2个热点突变(hMSH2 Intronl 218+8C＞G和Exon 91452-1455delAATG.)。结论1.本组资料表明我国青年大肠癌的发生率较高,发病趋势正逐步年青化,遗传因素可能起一定作用,须提高对青年大肠癌的认识和加强对遗传性大肠癌的早期检测及预防。2.通过IHC方法检测可疑HNPCC和HNPCC相关的子宫内膜癌hMLH1和hMSH2蛋白表达,分别确定高度可疑患者50例和20例,两种肿瘤MMR蛋白均以hMLH1表达异常为主,MMR蛋白异常表达与年龄及家族史密切相关,表明MMR蛋白异常表达是诱发低龄大肠癌和低龄子宫内膜癌的重要因素。3.运用微卫星分析检出43例高度可疑HNPCC患者,检出率为60.56%,50岁以下患者MSI检出率较高且各年龄段检出率相似,而老年患者MSI检出率显著降低,50岁以下患者都应纳入筛查范围;DHPLC在非变性的条件下进行微卫星检测,具有敏感和高通量的优点。4.MMR基因突变在低龄大肠癌中属于频发事件,20例高度可疑HNPCC经DHPLC检出13例突变,经DNA测序和序列比对,发现了9个突变,其中3个新突变,6个已知突变(其中热点突变2个)。