第一部分心脏干细胞(心脏肌球衍生细胞)的分离、培养和鉴定研究背景目前,对于缺血性心脏病的治疗大都是基于病因的干预性治疗,它们在替代死亡心肌细胞的功能及修复梗死后心肌方面的作用有限。干细胞移植是治疗缺血性心脏病的新方法之一,用于缺血性心脏病治疗的理想种子细胞最好无免疫原性,具有易收获、能在体外大量扩增、能在心脏微环境中很好地成长的特性,并能够促进受损心脏的修复。近年来,大量具有说服力的证据表明,心脏中存在有干细胞池,如果能够从受体自身心脏中获得干细胞,自然不存在免疫原性和不适应心脏微环境的情况,可能具有很好的治疗前景,而心脏肌球细胞(CSp)和心脏肌球衍生细胞(CDCs)就是心脏中存在的、含有心脏干细胞的混合细胞集团,其作为缺血性心脏病治疗的选择值得探讨。目的本部分通过分离和培养心脏本身的CDCs,观察其生长以及活性状态,且通过流式细胞术首次分析健康人和不同程度的缺血性心脏病患者来源的CDCs,及不同培养代数CDCs的细胞表型,旨在说明该类型细胞是一种可靠的干细胞治疗种子细胞。方法健康人和急性心肌梗死患者的心肌组织活检标本以及接受心脏移植而取出的受体自身心肌组织,利用组织块培养法收获细胞,再通过悬浮培养和(或)贴壁培养方式获得CSp和CDCS。在体外观察细胞形态,持续传代观察细胞活性,绘制细胞生长曲线。利用流式细胞术检测不同来源和不同培养代数的CDCs的表面标志物(?)(?)c-Kit、Sca-1、CD105、CD90、CD104b、CD31、CD34、CD45以及Lin1细胞的表达。结果CDCs能够在体外健康生长,并持续传代。流式细胞术分析CDCs中各种标志物阳性细胞数量后发现,CDCs中c-Kit+细胞约占6.0%、Sca-1+细胞约占2.5%、CD105+细胞约占100.0%、CD90+细胞约占31.0%、CD31+细胞约占6.0%、CD34+细胞约占5.8%、CD104b+细胞约占2.2%、CD45+细胞和Lin1+细胞各约占1.0%。相对于健康人组和急性心肌梗死组,在缺血性心脏病需要心脏移植患者的心脏中含有更多的c-Kit+、Sca-1+和CD104b+细胞,其所占百分比分别为7.20±0.41、5.98±0.37、6.38±0.51;2.86±0.44、2.23±±0.40、2.55±±0.43；2.17±0.26和2.24±0.35、2.57±±0.35(P<0.05)。不同培养代数CDCs间细胞成分差异无统计学意义(P>0.05)。结论①通过简单易行的方法能够从心肌组织中收获大量的CSp和CDCs。②不同人群、不同严重程度患者来源以及不同培养代数的CDCs具有相似的生长状态和细胞成分,该细胞对于所有需要细胞治疗的缺血性心脏病患者都是可以选择的。③CSp和CDCs是不含造血干细胞、心肌细胞的,存在于心脏本身的、含有心脏干细胞和支持细胞的、无免疫原性的、能够更加适应心脏微环境的混合细胞集团,是理想的种子细胞之一。第二部分心脏干细胞迁徙出血管的新机制：血管主动外推研究背景干细胞治疗是心血管疾病治疗领域中一个很有希望的手段,但是许多因素限制了其应用,如种子细胞的类型、细胞剂量的优化以及移植途径的选择等。选择移植途径就是选择细胞与受体心脏间的桥梁,好的移植途径对患者的创伤应尽可能小,但是目前创伤最小的经静脉途径移植,因大多数细胞被肺过滤掉及心脏内短期滞留率不到1%而极少应用。经过冠状动脉途径移植被认为是非常理想的途径,它通过标准球囊导管将细胞移植入再通的梗死冠脉中,移植细胞可以注入到氧和营养物质供应丰富的受损部位,不额外加重心肌的缺血损伤和增加心律失常的发生,也不增加细胞移植后支架内和罪犯血管再狭窄的可能性,目前许多临床试验就采用该方法作为细胞移植途径。但是,不得不承认的是通过冠状动脉移植的干细胞大多数还是通过心脏静脉系统进入到体循环,分布到其它器官,而在心脏内的存留率很低,24h时仅10%左右,因此,如要充分利用这种移植途径就必须提高移植细胞的滞留率或者提高仅存的10%细胞的作用,而要达到这个目的就必须了解干细胞发生作用的过程,即干细胞通过罪犯血管移植到达梗死或缺血部位,然后再进入到周围组织中开始修复活动的过程。到达血管周围组织的细胞才是真正能够发挥作用的细胞,而要到达周围组织必然经过干细胞迁徙出血管这个步骤。目的本研究通过结扎大鼠主动脉,向左心室腔内注射CDCs、CSp和无生物活性的荧光高分子球(PSPs)的方式模拟经冠状动脉移植细胞。不同时间点处死大鼠,IHC法观察干细胞出血管的过程,然后用整合素拮抗剂和基质金属蛋白酶(MMPs)及其同型异构体干预,观察其在体内和体外模型中对干细胞出血管的影响,旨在为增加干细胞的滞留率或者使数量有限的干细胞更加容易穿透血管发挥作用提供理论依据。方法将CDCs和CSp用FITC-超顺磁微球或DiO标记。结扎大鼠主动脉,将CDCs、CSp和PSPs注入左心室腔,不同时间点取出心脏,行冰冻切片,处死前用缺氧探针尾静脉注射。vWF抗体和DAPI染色血管和细胞核,分析CDCs、CSp或PSPs与血管腔和血管壁的关系,确认干细胞出血管的过程。再分别用整合素拮抗剂和MMPs阻滞剂腹腔注射。在体外利用血管内皮细胞和干细胞构建的体外出血管模型中,同样用上述药物干预,在不同时间点用IHC法、Masson染色、超声心动图和ELISA法等观察药物对干细胞出血管过程的影响。结果1.经冠状动脉移植后,CDCs、CSp或PSPs(?)很快进入微血管,占据了整个管腔,模型制造成功。24h时,CDCs和CSp虽仍在血管腔内,但绿色细胞被边缘的红色血管内皮细胞突触包围,此时大多数血管已经再通。72h时,移植的CDCs和CSp已经被排至血管外层区域,并且所有的血管都已完全通畅。而上述时间点中PSPs阻塞了毛细血管,因其无法穿透血管壁屏障,管腔完全闭塞,与前两组间差异有统计学意义(P<0.05)。我们明确了干细胞出血管的过程,证实该过程在72h内结束,这不同于以往报道的任何出血管的机制,因此命名为“血管主动外推”机制。另外无生物活性的物质不能被排出血管。2.当CSp放在单层贴壁生长的静脉内皮细胞上时,可以发现内皮细胞形成“口袋”,而CSp落入其中,体外构建出类似的“细胞出血管”模型；分别于共培养后0、2、4和6h时连续观察CSp与血管内皮细胞的关系,发现体外模型中6h后内皮细胞“口袋”包围CSp。3.关于整联蛋白对干细胞出血管影响的体内实验结果显示,腹腔注射整合素拮抗剂RGDS和其假拮抗剂GRGDTP,24h时处死大鼠发现注射RGDS组较注射G RGDTP组大鼠心脏中CSp的急性滞留数量少(P<0.05),内皮细胞“口袋”的形成少(P<0.05),迁移出血管的比率也小(P<0.05),组织缺氧程度明显加重(P<0.05)。4.关于整联蛋白对干细胞出血管影响的体外实验结果显示,使用了RGDS者“口袋”形成明显减少(P<0.001),与PSPs组类似。该过程中RGDS无论预先处理血管内皮细胞还是CSp,均将影响“口袋”的形成。5.关于MMPs对干细胞出血管影响的体内实验结果显示。移植CSp或PSPs24h后,在有CSp的血管壁内可以观察到MMP2的表达。术后0h、24h和72h定量分析MMP2荧光,发现移植CSp与移植PSPs相比,血管壁能够产生较多的MMP2(P<0.01)。移植CSp后连续3d注射广谱MMPs(?)印制剂GM6001和假抑制剂GM6001-NC,24h和72h发现应用GM6001组CSp向血管腔外迁移比例明显减少(P<0.01),24h时心脏中内皮细胞“口袋”的形成基本没有变化(P=0.77)。6.关于MMPs对干细胞出血管影响的体外实验结果显示,将基质胶平铺于共聚焦专用培养皿中模拟体内环境,将血管内皮细胞平铺上面,形成网状结构,再把CSp放入其中,结果许多远离内皮细胞网络的没有被包围起来,但是有些恰巧落在内皮细胞网状结构上的CSp,很快被血管内皮细胞突触包绕。用共聚焦显微镜系统动态观察被装进“口袋”中的CSp的活动,发现CSp能够长入下层的基质胶中。将MMPs阻滞剂GM6001和假阻滞剂GM6001-NC加入上述系统内,48h后,使用了GM6001组长入基质胶中CSp的数量比明显减少(P<0.05)；血管内皮“口袋”比例差异无统计学意义(P=0.69)。另外试验中我们发现MMPs阻滞剂只有与CSp接触才能较大程度上影响细胞的出血管效率。7.血管主动外推机制对心脏的影响。按照左心室腔内注射物质不同,分为PBS组、CSp组和PSPs组。3周后经Masson染色,PSPs组梗死面积明显大于其它两组(P<0.01)；24h和72h PBS组、CSp组和PSPs组LVEF基线值相似,3周后PSPs组LVEF明显下降(P<0.05)。并且术后24h和3周时,PSPs组血清中的肌钙蛋白Ⅰ明显升高(P<0.01)。这说明血管主动外推机制明显减少心肌细胞死亡。结论1.本研究首次提出的血管主动外推机制主要有三步：血管内细胞黏附相互识别、形成血管内皮细胞变形,形成“口袋”包裹干细胞和血管壁外层破溃,这个过程中血管是主动的。2.血管内皮细胞和干细胞通过整合素“交流”而相互作用,形成“口袋”。3. MMPs调节微血管壁破溃,将细胞最终排出血管腔。4.血管主动外推机制可能是较大干细胞或干细胞集团排出血管的关键机制,适时进行干预应该能够提高干细胞的移植效率,增强干细胞的治疗功能。第三部分心脏干细胞治疗急性心肌梗死小鼠中细胞数量与功能效益的研究研究背景急性心肌梗死当前的治疗方法主要是延缓疾病进展。心肌梗死后瘢痕形成,心肌的损伤将不可逆转。干细胞治疗在改善梗死后心肌负性重塑和心肌再生方面具有很好的效果,但是细胞的应用剂量一直以来都是模糊的,而没有细胞数量优化的临床研究得到的结论是不完善的,动物实验研究结果对临床研究的指导意义也应有待商榷,因此,细胞剂量的研究成为了重要课题。当然,不同种类干细胞的应用数量也可能有所不同。本课题研究的细胞是CSp。 CSp和CDCs是心脏中固有的、含有心脏干细胞和支持细胞的混合细胞集团。有实验直接对比了CDCs、骨髓间充质干细胞、脂肪源性间充质干细胞和骨髓源性单核细胞,结果证实在心肌梗死的治疗中CDCs可能具有更大的优势。最近结束的关于CDCs的Ⅰ期临床试验结果再次证实了它的安全性和优良的再生能力,而且还有实验表明CSp比CDCs具有更强的干细胞性,能够更好地保持干细胞活性,分泌更多的有益因子,对梗死后心功能的改善作用更强。另外,CSp在NOGA心内膜心肌电机械标测系统指引下心内膜注射的临床研究正在申请中,因此,对CSp使用剂量的研究就别具意义。目的本部分探讨CSp直接心肌注射治疗心肌梗死中细胞剂量和效益的依赖关系,并通过组织学分析,寻找产生与剂量相关效果的机制,旨在为大动物和人体试验提供可靠数据。方法培养患者心肌组织来源的CSp,用SCID-beige小鼠制备心肌梗死模型,在梗死区域分四个点注射PBS和由1×104、5×104、1×105和5×105CDCs形成的CSp细胞悬液。采用二维超声心动图检测LVEF, Masson染色分析心室结构,组织免疫荧光染色心脏冰冻切片观察新生血管平滑肌、分裂心肌细胞和凋亡细胞数量,Western blot法检测VEGF和SDF-la表达,分析不同剂量细胞移植后梗死心脏产生的不同变化。结果1.不同剂量细胞在心脏中24h滞留率。按照注射PBS和由1×104、5×104、1×105和5×105CDCs形成的CSp将小鼠分为五组。术后24h细胞在第二、三、四和五组心脏中的滞留率相似,分别为(%)(11.42±2.24)%、(9.97±4.24)%、(11.70±4.73)%、(10.23±3.95)%(P>0.05)。2.不同剂量细胞对心脏功能的作用结果。LVEF基线值相似,分别为31.48±1.87、29.56±2.14、30.53±2.38、30.92±4.34、32.87±1.98(P>0.05),术后3周后LVEF值分别为21.92±2.65、27.08±3.54、41.79±6.18、47.18±8.73、47.26±8.85(P＜0.05)。3.不同剂量细胞对心肌重塑的作用结果。Masson染色后分析术后3周的心脏冰冻切片,梗死壁厚度(mm)分别为0.17±0.06、0.34±0.09、0.93±0.35、0.97±0.35、1.06±0.32(P<0.05)；梗死区内活组织面积比分别为13.25±1.52、16.18±2.91、28.0±2.20、28.78±3.54、32.08±3.22(P<0.05)。4.不同剂量细胞再生作用的结果。梗死区内的α-SMA+细胞数分别为2.6±1.52、3.4±1.14、11.6±3.91、12.8±4.76、14.4±5.81(P<0.05)；Ki-67+/α-SA+细胞数分别为1.00±0.82、2.14±1.35、5.00±1.15、5.86±1.77、6.71±1.11(P<0.05)；TUNEL+细胞数分别为6.83±1.47、5.0±1.79、1.83±0.75、1.5±0.55、1.5±1.05(P<0.05)。所有的结果都显示出第二组较第一组有改善趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)；第三、四和五组间随细胞数量增加改善作用亦有上升趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)；第三、四和五组均较第一和二组有明显改善趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。5.检测心脏组织中的VEGF和SDF-1α表达。结果显示细胞剂量较高的第三、四和五组含量明显多于低剂量的第一组和对照组(P<0.05),第三、四和五组之间差异无统计学意义(P>0.05),对照组和第一组间差异无统计学意义(P>0.05),相对表达量灰度值比(与GAPDH相比)分别为VEGF:0.11±0.02、0.12±0.02、0.33±0.03、0.34±0.02、0.34±0.03(P<0.05)：SDF-1:0.04±0.01、0.05±0.02、0.16±0.02、0.16±0.03、0.17±0.02(P<0.05)。结论随着移植细胞数量的增加,对梗死后心脏的改善作用增强,但高于5×104移植细胞数量后,细胞数量的增加对心脏内再生、分裂心肌细胞及凋亡心肌细胞数量、梗死壁厚度及存活心肌数量和心功能的改善作用变化不大。因此我们推测在一定范围内细胞数量与所产生的作用成正比,达到平台期的那个剂量是最佳剂量。就本实验结果而言,小鼠心肌梗死模型中5×104是最佳剂量,该数量细胞指导下的人体试验细胞数量为1.50×108。第四部分直接心肌内注射血小板纤维蛋白支架促进内源性修复和改善心梗后心脏功能的研究研究背景在所有非传染性致死疾病中,心血管疾病占了首位,其中冠状动脉粥样硬化性心脏病又是心血管疾病中最常见的一种。心肌梗死的最终结局极有可能是心功能衰竭,而其中大量心肌细胞的损失在心功能衰竭进展中起着重要作用。目前常规的治疗手段以缓解症状为主,治疗效果有限。心脏移植虽能代替受损心脏,但供体难以获取,临床难以广泛应用,因此寻找新的方法从结构和功能上替代死亡的心肌组织刻不容缓。新近组织工程和生物材料的发展为缺血性心脏病的治疗或细胞血管成形术提供了很好的选择。可注射用生物材料可以通过微创的方式达到目标位置,可以作为治疗的载体或独自成为一种治疗手段。多种可注射用生物材料如纤维蛋白胶、胶原、藻酸盐、基质胶、自组织肽、细胞外基质乳液、合成高分子水凝胶和微球等已经用于心肌再生治疗,且有了一定的效果。一种理想的用于缺血性心脏病治疗的生物材料应该具有以下特点：取材、制备简单;可注射,对患者的创伤很小；可降解,能够适时为心脏修复提供支持；良好的生物兼容性,最好是来自于受体本身,这样可不引起或引起很小的排异反应；能够为受损心脏提供结构和功能上的支持。血小板纤维蛋白支架具有上述特性,且未见在缺血性心脏中应用的报道。目的本课题制备大鼠心肌梗死模型,将血小板纤维蛋白支架直接注射到梗死区域周围,通过IHC法、ELISA法、超声心动图、Masson染色等多种方法观察血小板纤维蛋白支架在促进梗死后心肌修复和改善心脏功能中的作用,探讨血小板纤维蛋白支架在心肌梗死治疗中的治疗潜能,为缺血性心脏病的治疗提供一个新方法。方法体外实验：从同品系大鼠腹主静脉抽血并提取含有血小板的血浆,与温热的DMEM等体积混匀制胶。观察血小板纤维蛋白支架的结构形态特征；与新生大鼠心肌细胞混合培养,观察新生大鼠心肌细胞的形态及活性；用ELISA法检测不同时间段血小板纤维蛋白支架条件培养基中的细胞因子。体内试验：利用冠状动脉结扎法制备大鼠急性心肌梗死模型。分两组观察：第一组(DMEM组)在梗死区直接心肌注射PBS；第二组(血小板纤维蛋白支架组)在梗死区直接注射血小板纤维蛋白支架。注射部位在梗死区域周边。微观上观察血小板纤维蛋白支架在心肌内的降解特征,观察新生心肌细胞、内皮血管、毛细血管密度、募集内源性修复、心肌细胞形态及炎症反应等情况；宏观上观察大鼠心肌梗死后心功能和大体形态的变化。结果体外实验结果1.含血小板血浆与DMEM混合,小于30s凝胶开始形成,120s内完全成胶。HE染色可见血小板纤维蛋白支架成纤维样结构,内含血小板。2. ELISA法检测不同时间段条件培养基中VEGF、IGF-1和HGF的表达,可见血小板纤维蛋白支架可以持续稳定表达活性细胞因子。3.血小板纤维蛋白支架中大鼠新生心肌细胞形态和活性与常规条件培养下差异无统计学意义(P>0.05),这说明血小板纤维蛋白支架无细胞毒性。体内试验结果4.血小板纤维蛋白支架在体内可以降解,第1天、第7天和第14天该胶的面积百分比分别为100.00%、(41.50±7.89)%和(10.47±5.45)%。5.将血小板纤维蛋白支架和PBS注入梗死大鼠心脏后第7天时,血小板纤维蛋白支架组较PBS组梗死区域中,心肌细胞数量明显增加(P<0.0001)；内皮细胞数量明显增加(P<0.05)；凋亡细胞数量明显减少(P<0.01)；c-Kit+细胞数量明显增加(P<0.01)；CD68+巨噬细胞数量明显减少(P<0.01),这说明血小板纤维蛋白支架能够促进心肌再生,募集干细胞进入梗死区域,且具有抗炎作用。6.血小板纤维蛋白支架和PBS梗死区域注射后3周,血小板纤维蛋白支架组较PBS组梗死区域中,毛细血管密度明显增加(P<0.001)；IHC染色和分离心肌细胞ICC染色均发现心肌细胞横截面积面积明显减小(P<0.001和P<0.05),这说明血小板纤维蛋白支架能够促进局部血管的生成,增加血流供应,并且有效地减轻存活心肌的代偿性肥大。7.血小板纤维蛋白支架组和PBS组3周时Masson染色定量形态学分析发现血小板纤维蛋白支架组梗死区域室壁增厚(P<0.05)；左心室腔面积减小(P<0.05)；梗死区域周长占左心室周长的百分比降低(P<0.05)。两组大鼠心功能基线值相同(P>0.05),但是3周时血小板纤维蛋白支架组心功能明显优于PBS组(P<0.05)。这说明血小板纤维蛋白支架能够逆转心肌梗死后心脏重塑,改善心脏功能。结论心肌内注射自体血小板纤维蛋白支架可以通过增加新生心肌细胞、内皮细胞数量,增加毛细血管密度,启动募集内源性修复系统,减少梗死部位炎症反应,维持正常的细胞形态,从而改善心肌梗死后心脏功能,是缺血性心脏病治疗和治疗载体的理想选择。第五部分心脏干细胞与血小板纤维蛋白支架联合移植在大鼠心肌梗死模型中的心脏再生研究研究背景可注射生物材料联合干细胞,如骨髓细胞、脂肪源干细胞和骨髓源性诱导心脏干细胞被证实能够改善心脏功能,而另一些研究则发现联合细胞治疗与单用生物材料治疗心肌梗死最终的结果相似,究其原因无外乎生物材料和干细胞搭配的合理性。只有好的生物材料联合好的干细胞种子,且两者之间又能相互促进才是好的选择,也会对心肌梗死后心脏的修复起到更大作用。近十年来,随着对心脏干细胞认识的不断加深,很多研究认为心脏干细胞具有组织再生功能,在体内能够分化成为多种类型的成熟细胞,如心肌细胞、血管内皮细胞和血管平滑肌细胞等,因此用干细胞治疗心肌梗死的研究引起了大家的普遍关注。CDCs是心脏干细胞中的一种,有实验证明CDCs较骨髓来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞以及骨髓单核细胞在心脏修复方面具有更大的优势。另外上一章中我们发现血小板纤维蛋白支架不仅具有良好的治疗效果,而且与心脏组织有良好的的兼容性,因此我们推测血小板纤维蛋白支架和CDCs(?)昆合后,血小板纤维蛋白支架可以为CDCs提供良好的3D生长系统,这不仅使干细胞具有良好的生长空间和微环境,而且还能够延长干细胞在心脏中的存留时间,有更加充裕的时间发挥作用；两者相互作用,促进心脏本身产生有利因子和CDCs发挥再生作用。目的本部分首先在体外研究血小板纤维蛋白支架与CDCs间的相互作用,再构建大鼠心肌梗死模型,用血小板纤维蛋白支架联合心脏干细胞移植,观察对大鼠心脏结构和功能的变化,研究预先种植干细胞的生物材料是否具有更强的保护作用并探讨其机制。方法体外实验：从同品系大鼠腹主静脉采血并提取含有血小板的血浆,与温热的DMEM等体积混匀制胶。观察血小板纤维蛋白支架的结构形态特征：CDCs在血小板纤维蛋白支架中的生长状况以及血小板纤维蛋白支架的降解。新生大鼠心肌细胞混合在含或不含CDCs的血小板纤维蛋白支架中培养,观察新生大鼠心肌细胞的形态及活性；采集不同时段血小板纤维蛋白支架的条件培养基用ELISA法检测细胞因子。体内试验：利用冠状动脉结扎法制备大鼠急性心肌梗死模型,分三3组：第1组(DMEM组)在梗死区直接心肌注射PBS；第二组(血小板纤维蛋白支架组,Gel组)在梗死区直接心肌注射血小板纤维蛋白支架；第三第3组(血小板纤维蛋白支架+CDCs组,Gel+CDCs组)。注射部位均在梗死区域周边。微观上观察新生心肌细胞、内皮血管、毛细血管密度、募集内源性修复、肌细胞体积及炎症反应情况；宏观上观察大鼠心肌梗死后心脏结构和功能。结果体外实验结果1.用ELISA法分析含和不含CDCs的血小板纤维蛋白支架的第2、5、9和14天的条件培养基中VEGF、IGF-1和SDF-1的含量,各时间点混合了CDCs的血小板纤维蛋白支架能够分泌更多的细胞因子(P<0.05)2.观察在血小板纤维蛋白支架中和常规条件下培养的CDCs扩增数量(相对于12h的细胞数),结果发现12h时、第3天、第7天和第14天的细胞数量比较,两组差异无统计学意义(P>0.05),提示血小板纤维蛋白支架不影响CDCs细胞扩增。第14天在血小板纤维蛋白支架中和在常规条件下生长的CDCs长短轴之比,前者明显大于后者(P<0.05)；再用LIVE/DEAD细胞活性／毒性试剂盒染色在血小板纤维蛋白支架中和在常规条件下的CDCs死亡细胞百分比,前者明显小于后者(P<0.05),这些说明血小板纤维蛋白支架不仅能促进细胞生长,而且很好地保持了细胞活性。3.为了评价体外血小板纤维蛋白支架的降解,我们在12h、第3天、第7天和第14天时测量血小板纤维蛋白支架中CDCs分布的"Z-distance"(评价血小板纤维蛋白支架的降解),结果发现14天后有将近2/3的支架降解。4.用IHC法观察培养第14天血小板纤维蛋白支架中CDCs,结果发现CDCs能够分化成表达血管特异性标志物α-SA、vWF和a-SMA的细胞。5.在含有CDCs的血小板纤维蛋白支架和单纯血小板纤维蛋白支架中培养的NRCMs,前者长短轴之比明显大于后者(P<0.05),且跳动MRCMs所占比例也明显增多(P<0.05),这说明血小板纤维蛋白支架联合CDCs能够更好地促进心肌细胞的生长以及保持良好的活性。体内试验结果6.制备大鼠心肌梗死模型,然后进行CDCs或血小板纤维蛋白支架移植。定量分析Gel+CDCs组和Gel组中内皮细胞、心肌细胞和c-Kit+细胞,结果前者明显多于后者(P<0.05),说明含有CDCs的血小板纤维蛋白支架更加有利于心脏的再生。7.分析Masson染色心脏冰冻切片,结果发现Gel+CDCs组梗死面积最小,梗死壁厚度最大(P<0.05),说明血小板纤维蛋白支架联合CDCs移植能够更好地逆转心室负性重塑,改善心脏的结构。8.超声心动图检查3组大鼠术后左室射血分数基线值相同(P>0.05),说明造模基本一致。3周后,在对照组中LVEF中进行性下降,最大的LVEF值在Gel+CDCs组(P<0.05),这说明含有CDCs的血小板纤维蛋白支架从结构上改变了梗死后心室,改善了梗死后心脏功能9.定量分析CDCs直接再生的作用,Gel+CDCs组中的CM-DiI+心肌细胞仅占28.7%和27.3%,说明血小板纤维蛋白支架联合CDCs所起的作用中仍然以旁分泌为主。结论1.血小板纤维蛋白支架中有利于CDCs生长,且两者联合促进心肌细胞的生长。2.梗死后心肌内注射含有CDCs的血小板纤维蛋白支架具有更好的保护作用。3.血小板纤维蛋白支架联合CDCs主要通过增加新生心肌细胞、内皮细胞数量,增加毛细血管密度,启动募集内源性修复系统,从而逆转或停止心脏负性重塑,改善梗死后心脏功能,是缺血性心脏病治疗的理想选择。