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目的:本研究以光裸方格星虫干为原料,通过蛋白酶水解提取分离氨基多糖,并对其免疫活性和抗衰老活性进行初步的研究。
主要内容:1.蛋白酶水解条件的确定:用枯草杆菌中性酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶三种蛋白酶进行试验,以酶解液中α-氨基酸态含量确定单酶和双酶法的水解条件; 2.提取分离的多糖的主要指标测定:氨基多糖粗品(CSG)得率,等电点沉淀法除杂精制多糖(SG<,1>)和CTAB络合沉淀法多糖(SG<,2>)的得率、总GAG含量、总氮量和葡萄糖醛酸含量等; 3.多糖的纯化和电泳分析:用DEAE-52纤维素纯化SG<,1>得到多糖纯化组分SG<,3>、SG<,4-1>和SG<,4-2>,琼脂糖凝胶电泳检测其纯度;4.免疫活性的检测:采用免疫器官指数法、碳粒廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验、脾淋巴细胞的增殖、NK细胞活性及对小鼠血清蛋白指标的影响实验检测CSG、SG<,1>和SG<,2>对机体免疫功能的影响;5.抗衰老活性的研究:通过测定小鼠血清中SOD、CAT的活性、MDA的含量及体外清除氧自由基的能力检测CSG的抗衰老活性。
结果:1.确定了双酶酶解条件:同时加入1.2%的枯草杆菌中性酶和1.0%木瓜蛋白酶,pH7.0、50℃酶解5 h; 2.得到多糖分离的主要指标:CSG、SG<,1>和SG<,2>的得率分别为5.87%、78.00%和9.20%; 3.柱层析流速对纯化有较大影响:在25~30ml/h时得到一个洗脱峰,在15~20ml/h时得到两个;4.纯度对电泳结果有很大影响:SG<,1>和SG<,2>杂质较多SG<,3>,SG<,4-1>和SG<,4-2>纯度较高;5.能够增强机体的免疫功能:适量CSG完全能够对抗CY所致的小鼠胸腺萎缩、脾萎缩及白细胞减少,使正常小鼠血清中的总蛋白和白蛋白含量比盐水对照组明显增高(p<0.01),使CY抑制小鼠的各项指标恢复正常,CSG、SG<,1>和SG<,2>均能促进巨噬细胞的吞噬功能和小鼠脾细胞增殖,作用的强弱顺序为SG<,2>>SG<,1>>CSG,提示纯度越高越好,并可与ConA协同。CSG和SG<,1>能够增强NK细胞的活性,在200μg/ml剂量时的作用效果最好。6.有较好的抗衰老活性:2 mg/ml时对超氧阴离子的清除率达38.3%,在2~4 mg/ml的浓度范围内对羟自由基有较强的抑制能力,并使正常小鼠血清中的SOD和CAT活性显著升高(p<0.001),能恢复CY抑制小鼠血清中的SOD和CAT制活力,并有最佳剂量。
结论:加入1.2%的枯草杆菌中性酶和1.0%木瓜蛋白酶,pH7.0、50℃时间5 h酶解光裸方格星虫,提取分离得到多糖,并纯化得到两个级分;在适当剂量下,光裸方格星虫多糖可以增强机体的免疫活性和抗衰老活性。