经皮腔内冠脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)后再狭窄(restenosis,RS)是影响冠状动脉粥样硬化性心脏病介入治疗预后的关键问题,严重制约了经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)的远期疗效,成为心血管领域的研究热点和难点。其病理基础是新生内膜的形成,而血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)异常增殖和凋亡不足则是其主要成因。因此,VSMC是RS的主要作用细胞,也是防治RS研究最重要的靶细胞。随着对RS分子水平机理研究的不断深入,发现许多因素如细胞因子、生长因子等可通过活化细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路影响细胞周期蛋白及凋亡相关基因,在VSMC增殖、分化、凋亡以及转移中发挥重要的调控作用。所以,针对VSMC增殖与凋亡调控因素的干预是RS防治的切入点。中医学虽无再狭窄病名,但从中医整体观念及辨证论治的角度出发,其仍归属“胸痹”、“心痛”、“厥心痛”的范畴。认为此病为本虚标实之证,以脏气亏虚为本,瘀血、痰浊阻滞为标。我们根据临床再狭窄患者的年龄特点,结合其证候转归,并运用中医学阴阳气血的基本理论,从中医角度治疗PTCA术后RS应在治重阳气的基础上,根据,临床应以益气助阳与活血化瘀并用,才能充分发挥中医药调节整体改善局部的治疗特色。本研究拟通过观察中药复方消斑通脉合剂中药血清对体外培养的大鼠VSMC增殖及凋亡的影响,初步探讨具有益气助阳,活血通脉作用的消斑通脉合剂对VSMC增殖及凋亡的可能作用机理,旨在为消斑通脉合剂对临床RS的防治提供切实的理论依据。第一部分理论研究中医防治PTCA术后再狭窄的辨证论治探讨研究目的:中医理论角度阐述具有益气助阳、活血通脉功效的中药复方消斑通脉合剂对PTCA术后再狭窄防治的可行性。研究方法:根据PTCA术后再狭窄患者发病的年龄特点、临床症状、体征,以中医学的核心理论阴阳学说为出发点,结合《黄帝内经》、《金匮要略》等历代中医古典文献的相关记载,运用中医学阴阳气血基本理论和辨证论治的理论思想,并结合现代药理学的研究成果,探寻具有益气助阳、活血通脉功效的中药复方消斑通脉合剂防治PTCA术后再狭窄的理论依据。研究结果:消斑通脉合剂可以应用于PTCA术后再狭窄的防治。第二部分实验研究实验一消斑通脉合剂对大鼠VSMC增殖的影响研究目的:通过观察不同体积分数的消斑通脉合剂中药血清对体外培养的大鼠VSMC增殖的影响,了解消斑通脉合剂中药血清是否具有抑制体外培养的大鼠VSMC增殖的作用,并确定最佳给药浓度。研究方法1.中药血清的制备:SD大鼠30只,雄性,体重180～220g,6～8周龄。随机分为正常血清组、中药血清组,中药血清组给予大鼠消斑通脉合剂中药复方常规煎剂(含生药2g/ml),按35g/kg/d灌胃,每天灌胃两次,每次间隔12h;正常血清组灌服等体积生理盐水。连续灌胃7d,末次给药2次,中间间隔lh,最后给药后lh,水合氯醛麻醉,无菌操作下取血。血样常温放置4h后4℃过夜, 2000rpm离心15min,0.22um微孔滤膜过滤,分装于EP管中,-20℃保存备用,用之前56℃水浴灭活30min。2.大鼠血管平滑肌细胞体外培养:大鼠A10主动脉VSMC细胞株采用高糖DMEM培养基培养,其中含有10%的FBS,青霉素(100U/ml)和链霉素(100ug/ml),细胞在37℃、5%C02、饱和湿度条件下培养。每2～3天更换培养基一次。待细胞生长至80～90%融合时,进行传代。并经血管平滑肌肌动蛋白(α-actin)免疫组织化学鉴定。3.MTT比色法测定消斑通脉合剂中药血清对VSMC增殖的影响将细胞分为4组,即正常血清组、5%中药血清组、10%中药血清组、20%中药血清组,每组10个复孔,5%中药血清与10%中药血清为20%中药血清用正常血清稀释而成,每孔保持20%血清浓度。细胞于37℃、5%C02、饱和湿度条件下分别培养为24h、48h、72h后,在不同的终点时间均换成无血清DMEM100ul,并加入MTT(5mg/ml) 20uL,继续孵育4h后,吸弃培养液,然后加入二甲基亚砜(DMSO) 150uL/孔,放于水平摇床轻微震荡10 min;用酶标仪在490nm波长处测定24h、48h、72h每个时间点各组细胞的吸光度(OD值),结果取均值(空白孔调零);并计算细胞增殖抑制率。对不同时间点各组细胞的OD值结果进行统计分析,得出最佳给药浓度。研究结果:MTT比色法结果显示,5%的中药血清组在24h、48h、72h时间点的与正常血清组比较,无统计学差异。而10%、20%的中药血清组在24h、48h、72h时间点的与相同体积分数正常血清组比较,其OD值在24h、48h、72h均有明显统计学差异,证明10%、20%的中药血清组具有抑制VSMC增殖的作用,在24h～48h之间表现最为明显。并且20%的中药血清组在24h、48h、72h时间点的抑制率均明显大于10%中药血清组,提示消斑通脉合剂中药血清呈时间和剂量依赖性的抑制VSMC增殖。实验二消斑通脉合剂对大鼠VSMC细胞周期及相关调控蛋白的影响研究目的:通过观察消斑通脉合剂中药血清对大鼠VSMC细胞周期分布及细胞周期相关调控蛋白的影响,了解消斑通脉合剂中药血清抑制VSMC增殖的作用机理。研究方法:根据MTT的结果,选择最佳中药血清浓度,分为正常血清组、中药血清组分别对VSMC作用12h、24h,用流式细胞仪碘化丙啶(PI)染色法分析正常血清组、中药血清组VSMC在12h、24h时间点细胞周期分布情况,对12h、24h时间点的流式细胞仪分析结果进行统计分析;选择最佳中药血清浓度,分为正常血清组、中药血清组,分别对VSMC作用6h、12h、18h、24h后收集细胞,应用Western blot的方法检测VSMC中Cyclin Dl、Cyclin E、p27蛋白在不同时间点的表达变化,并对结果进行统计分析。研究结果:流式细胞仪细胞周期分析结果表明,消斑通脉合剂中药血清在一定的范围内抑制VSMC由G0/G1期向S期转化,与正常血清组在12、24h两个时间点比较,中药血清组明显延缓了细胞周期进程,其G0/G1期比例较对正常血清组显著增多,而S期所占比例明显下降,使细胞周期阻滞于G1期。Western blot检测结果显示消斑通脉合剂20%中药血清呈时间依赖性的明显延缓Cyclin Dl、Cyclin E蛋白表达,与正常血清组比较有显著性差异。中药血清组对p27蛋白在不同时间点的表达没有影响,但与正常血清组比较,在12h、18h、24h时间点有显著差异。实验三消斑通脉合剂对大鼠VSMC增殖信号通路ERK的影响研究目的:通过观察消斑通脉合剂中药血清对大鼠VSMC磷酸化ERK1/2蛋白的表达变化,探讨消斑通脉合剂中药血清抑制VSMC增殖作用的信号转导途径。研究方法:选择最佳中药血清浓度,分为正常血清组、中药血清组分别对VSMC作用4h,分别在1h、2h、3h、4h收集细胞,应用Western blot的方法检测VSMC磷酸化ERK1/2蛋白表达变化。研究结果:Western blot法检测结果显示:消斑通脉合剂中药血清可以降低VSMC中磷酸化ERK1/2蛋白的表达水平,与正常血清组比较有显著性差异。实验四消斑通脉合剂对大鼠VSMC凋亡及Akt信号通路的影响研究目的:通过观察消斑通脉合剂中药血清对大鼠VSMC凋亡及凋亡相关信号通路Akt蛋白表达变化的影响,探讨消斑通脉合剂中药血清诱导VSMC凋亡作用的信号转导途径。研究方法:选择最佳中药血清浓度,细胞分为正常血清组、中药血清组分别对VSMC作用48h后,用透射电镜观察VSMC的超微结构改变;选择最佳中药血清浓度,细胞分为正常血清组、中药血清组分别对VSMC作用24h、48h后,应用流式细胞仪通过AnnexinV-FITC/PI双染方法分析VSMC在24h、48h凋亡率;选择最佳中药血清浓度,细胞分为正常血清组、中药血清组继续孵育4h,分别于1h、2h、3h、4h收集细胞,应用Western blot的方法检测磷酸化Akt蛋白表达变化。研究结果:透射电镜观察结果显示:正常血清组细胞形态正常,细胞核仁形态规则,核仁清晰;中药血清组对VSMC作用48h后,出现了典型的细胞凋亡表现,如细胞核形态不规则,胞质浓缩,核仁消失,核染色质固缩,边集于核膜下,内质网肿胀等。流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染方法凋亡率检测结果示:中药血清组对VSMC作用24h、48h后,随着作用时间的延长VSMC凋亡率明显增加;在24h、48h两个时间点与正常血清组比较有显著性差异;中药血清组在24h、48h两个时间点比较亦有显著性差异。Western blot法检测结果:中药血清组可以降低VSMC磷酸化Akt蛋白的表达水平,与正常血清组比较有显著性差异。结论1.消斑通脉合剂中药血清通过阻滞VSMC由G0/G1期向S期转化,延缓细胞周期进程而达到抑制VSMC增殖的作用。2.消斑通脉合剂中药血清延缓细胞周期进程与其降低ERK1/2蛋白与Akt蛋白磷酸化的表达水平密切相关,通过降低ERK1/2及Akt蛋白磷酸化的表达水平,延缓细胞周期蛋白Cyclin Dl的表达,并减少了p27蛋白的降解,p27蛋白的降解减少又可进一步抑制Cyclin/CDK复合物激活,从而使G0/G1期细胞向S期的转化减少。3.消斑通脉合剂中药血清抑制VSMC增殖的作用与其具有诱导VSMC凋亡作用直接相关。通过降低Akt蛋白磷酸化的表达水平,影响其下游底物的抗凋亡作用,VSMC凋亡增加,进而起到抑制VSMC增殖。4.消斑通脉合剂中药血清可通过多角度、多靶点抑制VSMC增殖,其作用机理符合现代分子生物学关于再狭窄机理的研究结果,可以作为临床再狭窄的防治药物。5.再狭窄应用益气助阳、活血化瘀并用的治疗方法是切实可行的,符合中医辨证论治的理论思想。