【摘 要】
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目的本项研究旨在探究tRNA衍生片段（tRNA-derived fragments,tRF）在动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）中是否通过靶向B4GALNT4调节蛋白的糖基化,进而对内皮细胞炎性及各种功能产生的调节效应及机理,为AS的发生发展研究提供了新的探索方向。方法（1）前期通过对AS临床样本的高通量测序,筛选出一条显著差异表达的tRNA衍生片段,即tRF-1:29-Gly-
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目的本项研究旨在探究tRNA衍生片段（tRNA-derived fragments,tRF）在动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）中是否通过靶向B4GALNT4调节蛋白的糖基化,进而对内皮细胞炎性及各种功能产生的调节效应及机理,为AS的发生发展研究提供了新的探索方向。方法（1）前期通过对AS临床样本的高通量测序,筛选出一条显著差异表达的tRNA衍生片段,即tRF-1:29-Gly-GCC-1（后文中简称AS-tRF）。利用荧光实时定量PCR实验（RT-q PCR）检测临床AS患者的病变动脉及健康动脉中AS-tRF的表达;通过RT-q PCR检测AS小鼠模型组织中AS-tRF的表达情况。（2）设计并合成AS-tRF模拟物及抑制剂并将其分别转染至人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）。首先通过RT-q PCR验证其转染效率;然后使用RT-q PCR检测相关黏附因子（MCP1、ICAM1、VCAM1）及炎症因子（IL-6、IL-8、TNF-α）的表达情况;通过细胞黏附实验和细胞划痕实验分别检测AS-tRF对HUVEC的黏附功能以及迁移能力的影响;接着,Western blot检测炎症及黏附信号通路标记蛋白（p-ERK、p-p38、p-JNK、p-c-Jun、p-AKT、p-p65及p-Iκbα）的表达情况。（3）使用生物信息学网站预测AS-tRF的潜在下游靶标乙酰氨基半乳糖转移酶B4GALNT4;后续通过RNA Pull down实验明确其为AS-tRF的下游靶标,可能参与到AS的发病机制中;使用RT-q PCR验证AS-tRF对B4GALNT4表达量的调控;同时通过Western blot检测体外HUVEC中AS-tRF对蛋白糖基化修饰水平的影响情况。结果（1）在AS患者血管组织样本、AS模型小鼠血管组织样本和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）处理的内皮细胞中均发现AS-tRF表达较对照组显著升高。（2）AS-tRF模拟物及抑制剂转染至HUVEC中具有良好的过表达或敲低效果。与对照组相比,过表达AS-tRF促进了内皮细胞的黏附、炎症以及迁移,而敲低AS-tRF可以抑制内皮细胞的黏附、炎症和迁移。通过WB实验验证过表达AS-tRF促进黏附、炎症相关调控通路中部分蛋白表达水平的升高,相反敲低AS-tRF可抑制蛋白表达水平。同时,在LPS病理条件下诱导的内皮细胞中,AS-tRF过表达或敲低后具有相同的调控功能。（3）结合生物信息学方法,利用RNA Pull down及RT-q PCR实验,筛选并鉴定出B4GALNT4为AS-tRF的下游靶标。AS-tRF可上调B4GALNT4的m RNA表达量;AS-tRF过表达后细胞中糖基化修饰水平增高。结论我们的这项研究成果首次揭露了tRF中AS-tRF可能通过靶向B4GALNT4调节细胞中蛋白的糖基化,进而对内皮细胞黏附、炎症功能及迁移的调控作用及机制。AS-tRF可能促进AS病变的发生和发展过程。这项研究将为AS-tRF作为AS潜在的治疗靶标提供了理论基础,并为AS的临床治疗提供一种新的策略。
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