研究背景糖尿病尤其是2型糖尿病（type2diabetes mellitus，T2DM）的发病率和病死率日趋上升。2013年我国糖尿病患者人数为1.14亿；到2035年，中国的糖尿病患病人数将达到1.43亿。2型糖尿病已经成为危害人类健康和社会经济发展的全球性问题，其成为继癌症、心血管疾病之后威胁人类健康的第三大疾病。进一步明确糖尿病发病机制，并寻求更为有效的防治措施已经刻不容缓。骨骼肌是胰岛素主要靶器官之一，其在胰岛素抵抗发生发展中扮演重要角色。大量研究显示，肥胖、代谢综合征和2型糖尿病患者表现为逐渐升高的血浆支链氨基酸（branched-chain aminoacids，BCAA）水平，且血浆BCAA水平与肥胖患者胰岛素抵抗密切相关。Newgard等人研究发现，高脂诱导的小鼠骨骼肌中BCAA显著升高，但其原因尚不完全清楚。BCAA包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，属于人体营养必需氨基酸，食物是BCAA的主要来源。BCAA不仅是机体重要的能源物质，在各种特定条件下氧化分解，释放能量；还是其它多种具有重要生物活性物质如蛋白质、激素、酮体等的合成源料。更为重要的是，它还可作为重要的信号分子，通过雷帕霉素靶蛋白（mammalian targetof rapamycin，mTOR）等途径调节细胞的生长和代谢。人体主要依赖调节BCAA分解代谢维持其含量的稳态。骨骼肌是BCAA分解代谢的“场所”之一，在限速酶支链α酮酸脱氢酶（branched-chain alpha keto acid dehydrogenase，BCKD）复合物的催化作用下，BCAA生成相应的脂酸并进入三羧酸循环或转变为其它生物活性物质。BCKD复合物的活性取决于其E1α亚基丝氨酸293位点的磷酸化（失活）和去磷酸化（激活）状态。但是，2型糖尿病动物骨骼肌BCAA水平升高是否与BCKD活性改变有关及其分子机制，目前尚无相关报道。脂联素（Adiponectin，APN）是由脂肪细胞分泌的一种细胞因子。众多的研究证实，脂联素具有广泛的生物学作用，包括调节糖脂代谢、抑制炎症反应/保护血管、抗缺血心肌保护作用。研究还证实，脂联素能够通过过氧化物酶增殖物受体、Rab5和腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）等信号通路发挥其调节糖脂代谢的作用。其中，AMPK是脂联素最为重要的下游信号分子，AMPK介导脂联素的胰岛素增敏、心肌及血管保护、糖脂代谢调节等作用。然而，脂联素是否参与骨骼肌BCAA分解代谢；AMPK是否介导脂联素调节BCAA代谢尚不清楚。研究目的1.制备2型糖尿病小鼠模型，观察其骨骼肌BCAA的代谢情况。2.明确脂联素能否调节2型糖尿病小鼠骨骼肌BCAA分解代谢。3.探讨脂联素调节2型糖尿病小鼠骨骼肌BCAA分解代谢的分子机制。研究方法1.用低剂量链脲菌素（streptozocin，STZ）和高脂饮食诱导的方法建立T2DM模型。每天监测小鼠随机血糖，第12周时采用IPGTT法检测葡萄糖耐量，采用ELISA方法检测血浆胰岛素水平。2.采用ELISA方法检测野生型（WT）、小鼠、ob/ob小鼠及T2DM小鼠，APN治疗前后其骨骼肌中BCAA水平变化情况。3.采用ELISA方法检测WT、APN-/-、WT+HD（高脂诱导）、APN-/-+HD、APN-/-+HD+APN组小鼠骨骼肌BCAA水平。以及Western blot法检测P-BCKDE1α/BCKDE1α水平。4.分别给予诱导的T2DM小鼠PBS对照、APN（5mg/kg体重）、AICAR（200mg/kg体重）及APN（5mg/kg体重）+CC（20mg/kg体重）治疗3天4次。采用ELISA方法检测小鼠骨骼肌BCAA水平、Western blot法检测骨骼肌P-AMPK/AMPK和P-BCKDE1α/BCKDE1α水平。5.将高BCAA培养的骨骼肌成肌细胞系（C2C12细胞）分为：正常对照（vehicle）及APN（5μg/ml）组。检测给予APN治疗后采用ELISA方法检测不同时间点（0min、30min、1h、3h、24h）时上清中的BCAA水平，采用Western blot法检测P-AMPK/AMPK及P-BCKDE1α/BCKDE1α水平。6.培养的C2C12细胞，高BCAA孵育后分为4组：正常对照（vehicle）、APN（5μg/mL）、AICAR（20μmol/L）及APN（5μg/mL）+CC（50μmol/L）组。药物治疗后1h ELISA方法检测各组上清中BCAA水平、Western blot法检测细胞P-AMPK/AMPK及P-BCKDE1α/BCKDE1α水平。实验结果1.检测小剂量STZ+高脂饮食诱导小鼠的随机血糖、血浆胰岛素，行IPGTT试验，将血糖水平升高、血浆胰岛素水平升高、葡萄糖耐受不良者视为T2DM建模成功。2.检测了WT、ob/ob及T2DM组小鼠骨骼肌中的BCAA水平，结果显示T2DM及ob/ob组小鼠骨骼肌中BCAA水平明显高于正常组。给予各组小鼠脂联素腹腔注射5mg/kg，1次/日，连续3日4次治疗，末次注射后1h取骨骼肌，检测BCAA水平。结果显示APN治疗后T2DM与ob/ob组骨骼肌BCAA水平显著降低，说明脂联素可以降低2型糖尿病小鼠骨骼肌中BCAA的水平。3.检测WT、 WT+HD、 APN-/-、APN-/-+HD组小鼠骨骼肌内BCAA及P-BCKDE1α/BCKDE1α水平，结果显示： WT、WT+HD组无差异，与APN-/-组相比，APN-/-+HD组骨骼肌BCAA水平明显均升高、P-BCKDE1α/BCKDE1α水平也升高，提示APN-/-+HD组小鼠骨骼肌中支链氨基酸分解的限速酶活性降低导致BCAA水平升高；检测APN-/-+HD以及APN-/-+HD+APN组BCAA及P-BCKDE1α/BCKDE1α水平发现，与APN-/-+HD组相比较，APN-/-+HD+APN组骨骼肌P-BCKDE1α/BCKDE1α明显下降，BCAA水平也下降，因此可以得出结论，脂联素治疗，上调BCKD酶的活性、进一步下调2型糖尿病小鼠骨骼肌BCAA的水平。4.我们分别给予T2DM小鼠PBS对照、APN（5mg/kg体重）、AICAR（200mg/kg体重）及APN（5mg/kg体重）+CC（20mg/kg体重）治疗3天4次后，检测骨骼肌BCAA水平、P-BCKDE1α/BCKD E1α、P-AMPK/AMPK水平。结果显示：与对照组相比， AICAR和APN组骨骼肌中BCAA、P-BCKDE1α/BCKD E1α水平均下降、P-AMPK/AMPK水平升高，这说明增强AMPK活性能够增强骨骼肌BCKD E1α酶活性、促进BCAA的分解、除低骨骼肌BCAA水平。而与APN组相比，APN+CC组骨骼肌P-AMPK/AMPK降低、P-BCKD E1α/BCKD E1α、BCAA的水平升高，提示给予AMPK抑制剂抑制AMPK活性，APN失去了上调T2DM小鼠骨骼肌BCKD E1α活性，促进其骨骼肌BCAA分解代谢的作用。5.与对照组相比，给予脂联素后30min开始，其上清中BCAA水平即开始下降，1h时下降最明显，直到3h仍有下降，24h时无统计学意义。与对照组相比，P-AMPK/AMPK水平给药后30min、1h和3h，P-AMPK/AMPK的水平均升高，P-BCKDE1α/BCKD E1α给药后30min、1h和3h下降。提示APN可以上调AMPK及BCKD活性，促进骨骼肌细胞对上清中BCAA的分解，而且，从我们的实验结果得知，APN治疗1h是BCAA水平下降最为显著的时间。6.我们用药理学手段，将高BCAA培养的骨骼肌细胞分为对照、APN（5μg/mL）、AICAR（20μmol/L）以及APN+CC（50μmol/L）组。分别给药处理1h，结果显示给予AICAR或APN组上清BCAA较正常组明显降低，P-BCKDE1α/BCKDE1α水平也下降；而与单纯脂联素组相比较， APN+CC组上清BCAA及P-BCKDE1α/BCKDE1α水平均升高。进一步提示，离体培养的骨骼肌细胞上，APN可以直接通过激活AMPK调节高BCAA培养的BCAA代谢，而且APN调节骨骼肌细胞BCAA分解代谢独立于其糖脂调节作用之外。结论1.2型糖尿病时脂联素水平降低是骨骼肌BCAA分解代谢异常的可能原因。2.独立于脂联素改善糖脂代谢作用，脂联素通过AMPK参与2型糖尿病骨骼肌BCAA分解代谢的调节。3.脂联素可作为治疗2型糖尿病骨骼肌BCAA分解代谢异常的重要靶点。