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研究背景与研究目的:酒精性肝病是由长期大量饮酒造成的一类代谢性疾病,其主要病变包括脂肪堆积,纤维化和肝硬化等。据统计,至少60%的肝脏疾病相关死亡是由于过量饮酒造成的,目前认为氧化应激是造成酒精性肝病发生和发展的主要原因,抗氧化应激被认为是最直接和最有效的酒精性肝病治疗策略。我们实验室前期研究发现,CD38基因缺失的小鼠胚胎成纤维细胞对H2O2和缺氧复氧诱导的氧化应激损伤具有显著的保护作用,同时CD38干扰可以改善由心脏脂质超载诱导的氧化应激损伤,然而CD38是否可以通过影响氧化应激影响酒精在肝损伤中的作用尚无文献报道。本课题拟在体外制备酒精诱导的肝细胞损伤模型,利用原代CD38基因敲除肝细胞研究其在酒精引起肝细胞氧化应激损伤中的作用及其具体机制,从而为酒精性肝病的防治提供新的作用靶点与研究思路。实验方法:1.肝原代细胞的提取与酒精诱导的肝细胞损伤模型的制备:1)通过在体灌流法分离培养6-8周龄C57BL/6小鼠原代肝细胞;2)梯度浓度酒精处理体外培养的原代肝细胞10小时,用DCFH-DA荧光探针标记细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）,荧光显微镜检测细胞荧光强度;3)以1%酒精处理体外培养的原代肝细胞,检测不同时间点细胞ROS;4)Q-PCR和Western Blot法检测酒精对CD38转录与表达的影响。2.CD38敲除对酒精诱导细胞氧化应激损伤作用的分析:分离培养野生型和CD38基因敲除小鼠原代肝细胞,1%酒精处理10小时以诱导细胞氧化应激损伤模型。1)Q-PCR和Western Blot检测细胞中CD38敲除效率;2)流式细胞仪检测细胞ROS含量;3)多功能酶标仪检测线粒体膜电位;4)TBA法检测细胞丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量。3.机制分析:1)Western Blot检测酒精处理后野生型和CD38敲除组氧化应激相关蛋白SOD2、NOX2和FOXO3的表达;2)WST法检测超氧化物歧化酶活性（SOD）;3)Q-PCR检测CD38基因敲除或过表达对酒精代谢相关基因ALDH2 mRNA水平的影响。实验结果:1.酒精浓度梯度处理原代肝细胞10小时后,细胞ROS水平随酒精浓度增加明显升高,并且CD38 mRNA表达量随酒精浓度增加而降低。1%酒精处理原代肝细胞,随着时间延长细胞ROS累积增加,并且在十小时左右达到最大量。2.1%酒精处理原代肝细胞十小时后,相比于野生型对照组,CD38基因敲除能够明显降低细胞ROS,MDA含量,并改善酒精诱导的线粒体膜电位降低。3.CD38基因敲除可以促进总SOD活性,但抑制SOD2的蛋白表达,然而并不影响FOXO3蛋白表达。酒精处理肝细胞后CD38基因敲除可以抑制NOX2表达。4.CD38基因敲除促进肝细胞ALDH2 mRNA表达,过表达CD38抑制ALDH2 mRNA表达。结论:CD38基因敲除对酒精诱导的肝细胞细胞氧化应激损伤具有保护作用。敲除CD38基因可促进肝细胞超氧化物歧化酶活性,加速ROS清除;同时CD38敲除促进ALDH2表达,从而改善酒精诱导的氧化应激损伤。