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结直肠癌是世界上第三大恶性肿瘤,约有30%的患者在接受传统治疗后仍发生复发转移并导致死亡。HAb18G/CD147是广泛表达于多种肿瘤和炎症的跨膜糖蛋白,它的表达增高已被证实与多种肿瘤的发生、发展和转移成正相关性。人源化5A12(h5A12)是一种新开发的抗HAb18G/CD147人源化单克隆抗体,对大肠癌组织的免疫结合拥有较高灵敏度与特异度。小分子化疗药物单甲基阿里他汀E(MMAE)是一种强烈的微管蛋白抑制物。将h5A12与MMAE通过合适的化学合成方法偶联在一起成为兼具高特异性和高细胞毒性的h5A12-MMAE抗体-药物偶联物(ADC)成为治疗结直肠癌的一种极具潜力的方案。本课题来源于国家科技重大专项重大新药创制项目,旨在通过化学合成、质量控制、药效学和药代动力学研究四个方面对h5A12-MMAE进行深入研究。第一部分:h5A12-MMAE的抗体筛选和化学交联首先,多种癌组织芯片的免疫组织化学染色(IHC)结果显示,作为ADC抗体部分的h5A12对结直肠癌组织的灵敏度和特异度分别达到63.2%和88.6%,表现出很好的针对结直肠癌的靶向性。其次,通过对h5A12-MMAE多种化学交联的方法和条件的摸索,MMAE分子通过缬氨酸-瓜氨酸连接子(val-cit linker)成功偶于h5A12单抗上被还原的二硫键,成为了一种全新的ADC药物——h5A12-MMAE偶联物。第三,经过交联方案的不断优化,产业化制备体系得到建立,交联效率和产物产量得到了大幅提高,单次可生产约500g,产率达到82.5%。第二部分:h5A12-MMAE的质量控制研究首先对实验室规模h5A12-MMAE样品的质量控制检测方法进行了摸索,建立了运用紫外光谱、超高效液相色谱-二级质谱联用、毛细管电泳、尺寸排阻色谱和表面等离子共振等技术对多个关键质量控制参数进行了鉴定的方法学平台,并确定了相关质控参数。其中20160706批次ADC药物-抗体交联比(DAR)为3.60,纯度大于99%,表征抗体-抗原亲和力的解离常数(KD)约为5×10-10等。掌握这些最基本参数及其鉴定方法,有助于生产者了解ADC药物的性质规律,从而确立基本的h5A12-MMAE质量控制标准,为h5A12-MMAE扩大至中试生产提供参考依据。第三部分:h5A12-MMAE的药效学研究在掌握了h5A12-MMAE的核心技术参数后,我们进行了药物的体外和体内的药效学研究。在体外实验中,h5A12-MMAE对三株结直肠癌细胞SW480、SW620和HT-29的半数抑制浓度(IC50)分别达到1.167 nmol/L、4.340 nmol/L和10.626 nmol/L,远高于常用的化疗药物,提示h5A12-MMAE对结直肠癌细胞具有很高的抑制作用。在体内,结肠癌细胞SW480荷瘤裸鼠的大规模药效学实验结果显示,4周尾静脉注射给药后h5A12-MMAE抑制SW480皮下移植瘤的半数有效剂量(ED50)为1.33mg/kg(瘤体体积)或1.22mg/kg(瘤体湿重),且荷瘤裸鼠体重变化恒定,显示h5A12-MMAE具有非常好的体内药效和药物安全性。重复实验得到相似结论:4周尾静脉注射给药后h5A12-MMAE抑制SW480皮下移植瘤ED50为1.60mg/kg(瘤体体积)或1.34mg/kg(瘤体湿重);抑制HT-29皮下移植瘤ED50为1.26mg/kg(瘤体体积)或1.24mg/kg(瘤体湿重)。同时,荷瘤裸鼠瘤体切片的IHC结果验证了h5A12-MMAE通过特异性结合到高表达HAb18/CD147的肿瘤细胞表面并释放MMAE从而发挥细胞杀伤作用的药效机制。第四部分:h5A12-MMAE的药代动力学研究ADC药物不同于普通的化疗药物,其结构的复杂性使其同样具有很复杂的体内代谢性质。在确定h5A12-MMAE拥有很好的药效学性能后,为了了解它在体内的代谢途径和器官分布,对h5A12-MMAE在荷瘤裸鼠的体内的药代动力学性质进行了研究。通过绘制h5A12全抗的血药浓度-时间曲线以及残留的完整结构h5A12-MMAE的血药浓度-时间曲线,初步掌握了h5A12-MMAE在体内的代谢规律。同时,对裸鼠肿瘤肝组织中MMAE的残留进行免疫组织化学(IHC)染色结果证明MMAE的体内通过肝脏完成代谢。结论:综合所有的研究结果可得出以下几点结论。第一,h5A12单抗对结直肠癌组织具有很高的灵敏度和特异度,适合成为治疗结直肠癌的ADC的单抗部分。同时,经过工艺优化,h5A12-MMAE的产业化制备体系得到确定,交联效率和产物产量得到了提高。第二,提出了针对h5A12-MMAE药物的质量控制标准,建立了质量鉴定的方法学平台,并成功摸索出了关键参数的检测方法。第三,体内体外药效实验证明h5A12-MMAE兼具很高的抑瘤效果和安全性。机制研究验证了MMAE分子在肿瘤部位的定位。第四,通过h5A12-MMAE的药代动力学研究,掌握了h5A12-MMAE体内代谢的规律和毒性成分MMAE的代谢途径。本研究作为后续的h5A12-MMAE成药性研究以及临床前实验必不可少的实验依据,具有及其关键的参考意义。