目的：1、利用实时荧光定量PCR（Real-TimeFluorescentQuantitative,PCR）方法设计并建立BKV检测试剂盒，便于实验室对BKV进行简单快捷且大规模的筛选和预测。2、研究肾移植术后受者无创性实验室检测（尿沉渣分析Decoy细胞，尿、血标本检测BKVDNA载量）用于诊断BKV感染并预测BKVAN的价值，分析确定本实验研发的BK病毒检测试剂盒用于诊断BKV感染及预测BKVAN进展的标准值（范围）。3、通过单中心前瞻性的临床实验研究，分析影响BK病毒感染及并发BKVAN的危险因素。4、对BKV血症阳性和病理学诊断BKVAN的移植受者进行初步的临床干预治疗，评估疗效。方法：1、设计并建立实时荧光定量PCR方法检测BK病毒试剂盒：（1）根据针对BK病毒基因组自行设计特异性引物BKV-F和BKV-R以及Taqman荧光探针BKV-P。（2）BK病毒DNA聚合酶链式反应液的配制。（3）检测反应。（4）BK病毒样本的处理与DNA提取。（5）构建BKV定量标准品I-IV。（6）反应结果判断。（7）结果验证：将检测阳性的扩增产物进行基因测序，测序结果经BLAST比对后证实为BKV基因序列。（8）建立BK病毒检测试剂盒。2、研究肾移植术后受者无创性实验室检测方法价值：（1）根据制定的入组标准选择2010年02月01日至2011年01月31日在解放军第309医院器官移植中心进行同种异体肾移植术的116例受者作为研究对象，分别在移植术前病毒检查及移植术后第0.5、1、3、6、9、12和15个月时间点定期收集受者的尿液和外周血(PB)标本，进行尿脱落细胞形态学镜检（巴氏染色法）Decoy细胞，并应用本实验研发的BKV检测试剂盒检测尿和血标本中BKVDNA载量，记录检测结果。（2）对具备指征的移植术后受者行组织活检（在B超引导下），对移植肾进行病理学诊断（普通染色及免疫组化法）。3、将入选研究对象按照Decoy细胞阳性、病毒尿症（viruria）阳性、病毒血症（viremia）阳性和病理学确诊BKVAN分为四组，分别统计记录性别﹑年龄﹑免疫诱导方案﹑供肾类型﹑术后并发糖尿病（PTDM）﹑急性排斥反应和(AR)术后早期肺部感染（pneumonia）以及免疫诱导方案、单独和联合免疫抑制方案等资料，统计肾移植术后BKV的发病率、发病趋势，分析BKV检测试剂盒诊断BKV感染并预测BKVAN的价值，确定诊断标准值（范围），并进一步分析影响肾移植术后BKV感染及BKVAN的相关危险因素。4、依据国外参考文献资料，尝试对出现BKV血症及BKV相关性肾病（BKVAN）受者进行临床干预，观察治疗前、后BKVDNA载量及相应的肾功能等指标的变化情况。5、应用Excel2007软件进行实验数据录入及表格绘制。应用SPSS统计软件（16.0版）统计学分析，符合正态分布的数据应用平均值±标准差表示，并应用随机分组t检验、方差分析进行统计学分析，不符合正态分布的数据应用平均值，最小值和最大值表示，并应用秩和检验进行统计学分析。应用ROC曲线下面积对比分析BK病毒尿症和BK病毒血症预测BKVAN进展的价值，应用相关分析和logistic回归分析BK病毒感染的危险因素。应用graphpad（5.0版）软件进行绘图制作。结果：1、研发的BKV试剂盒检测阳性结果的范围为1.0×103copies/ml到1.0×1010copies/ml。不与包括乙肝病毒（HBV），丙肝病毒（HCV），EB病毒（EBV），人巨细胞病毒（HCMV），人类乳头状瘤病毒B19（HPVB19）和JC病毒（JCV）等其它病毒发生交叉反应。标本检测时间一般为1.5至2小时（与样本量有关）。2、经过15个月定时监测116例肾移植受者的结果显示尿沉渣Decoy细胞阳性（Median7个/10HPF，[1-48个/10HPF]），BK病毒尿症（Median2.63×105copies/ml，[1.78×103-8.54×109copies/ml]），BK病毒血症（Median2.70×104copies/ml，[1.95×103-6.31×106copies/ml]）的发生率分别为53.46%，24.17%和20.72%，活检穿刺病理学诊断BKVAN受者共4例，发病率为3.45%。移植术后3个月左右是Decoy细胞阳性、BK病毒尿症及BK病毒血症发生的高峰时段。3、移植术后尿BKVDNA载量和血BKVDNA载量随时间的变化趋势基本一致，尿液BKVDNA载量的平均值水平（Log10）是血BKVDNA载量的平均值水平（Log10）的2.56倍。4、（1）发生BKVAN受者的尿BKVDNA载量中位数为7.36×107copies/ml，未发生BKVAN但病毒血症阳性受者的尿BKVDNA载量中位数为5.73×105copies/ml，而未发生BKVAN且病毒血症阴性（即仅为病毒尿症阳性）受者的尿BKVDNA载量中位数为5.53×105copies/ml，前两者及三者之间比较有统计学差异（P=0.02），但后两者比较未发现统计学差异（P=0.334）。（2）发生BKVAN受者的血BKVDNA载量中位数为5.07×105copies/ml，未发生BKVAN受者的血BKVDNA载量中位数为4.33×105copies/ml，两组比较具有统计学差异（P=0.04）。（3）4例确诊BKVAN的受者的病毒血症及病毒尿症均为阳性。5、应用相关分析和logistic回归统计学结果显示，发现促进116例受者移植术后BKV血症进展的一般临床独立危险因素为术前病毒血症阳性（r=0.457，P=0.000）。其它包括性别﹑年龄﹑免疫诱导方案﹑供肾类型﹑术后并发糖尿病、急性排斥反应和术后早期肺部感染等因素与BKV感染和BKVAN无相关性。6、116例移植受者术后服用CsA和FK506的受者BKVDNA载量阳性的例数分别为18例（15.52%）和34例（29.31%）。与免疫抑制方案有关的独立危险因素为术后服用FK506（r=0.232，P=0.012），而服用CsA则显示了负相关关系（r=-0.232，P=0.012）。联合应用免疫抑制药物方面，CsA+MMF组合显示仍显示为负相关关系（r=0.236，P=0.11），而FK506+MZR组合可能是引发病毒血症的危险因素（r=-0.197，P=0.034）。DGF可能是受者术后尿中出现Decoy细胞的独立危险因素（r=0.195，P=0.036）。7、根据2009年欧洲KDIGO指南和2010美国移植学会指南方案，对24例BKV血症（包括4例BKVAN受者）阳性受者进行减少免疫抑制剂剂量或转换免疫抑制剂方案等干预治疗，未发现移植肾丢失和急性排斥反应事件。结论：1、利用自行研究设计的BKV检测试剂盒，可以对血或尿标本进行快速定性、定量检测，具有敏感性高、特异性好和成本低的优势。2、经临床实践显示，本研究所开发的BKV检测试剂盒可适用于较大规模临床工作的开展，可以作为免疫妥协状态下患者BKV感染的筛查监测以及BKVAN的预防和疗效评估的首选无创性实验室工具，改变了现有技术中需要进行组织活检的现状。3、肾移植术后第3个月是受者发生BKV感染的高峰时段，此段时间需密切监测尿中Decoy细胞及尿、血标本中BKVDNA载量变化，及时对BKV血症受者进行临床干预，可减少移植受者进展为BKAVN的几率。4、应用本研究中心开发的BKV检测试剂盒，当血BKVDNA载量≧105copies/ml或尿BKVDNA载量≧107copies/ml时预测移植术后受者进展为BKVAN的几率较大，可将以上两项指标作为诊断BKVAN进展的阈值或阳性指标。5、移植术前受者BKV血症阳性是术后BKV血症发生的一般临床独立危险因素，服用FK506或FK506+MZR的免疫抑制剂方案是术后BKV血症和进展为BKVAN的免疫相关独立危险因素。因此移植术前对供、受者进行常规的BKV筛查是预防和减少术后进展为BKV血症和BKVAN的有效措施之一。对术前BKV血症阳性受者，术后更应密切监测BKV感染活动状态，同时给予适当的预防性临床干预措施。6、对于明确诊断的BKV血症和BKVAN受者，采取减少免疫抑制剂剂量或转换环孢素（CsA）是一种有效的治疗策略，且不会增加急性排斥反应和移植物丢失的风险，但治疗期间需密切监测急性排斥的发生。