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富马酸酶(fumarase,EC4.2.1.2)是三羧酸循环中的关键酶之一,催化富马酸转化为L-苹果酸这一可逆反应。由于具有相对较好的热稳定性且反应不依赖于铁离子,其中的富马酸酶C(FumC)被应用于L-苹果酸的工业生产。随着国家对环保的日益重视和环保税的开征,企业在节能降耗减排方面的需求也与日俱增。进一步提高FumC的稳定性,不但可以降低固定化酶在工业使用环境下的失活速率,延长其使用寿命,而且有利于降低单位产品的原料和能源消耗,减少污染物排放,具有重要的经济和社会效益。本论文在调研国内外文献的基础上,选取了五种不同来源的FumC基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行克隆表达,基于单位发酵液体积的酶活与纯酶比酶活的测定和比较,选取了来源于大肠杆菌的FumC(EEF)和来源于谷氨酸棒状杆菌的FumC(EGF)进行转化率和稳定性的研究。将含这两种酶的重组菌全细胞固定化,考察其催化富马酸产L-苹果酸的反应,结果表明,两者对底物的转化率都能达到80%左右,且在持续22个反应批次间转化率都没有明显下降,均具有工业应用的潜力。所以,选择这两种FumC同时进行热稳定性的改造。首先,以EGF为亲本,在成功建立了适用于本实验的高通量筛选方法后,采用易错PCR于优化后的Mn2+浓度下构建了突变文库,从中筛选得到一个突变体2G(A411V),它的比活力为684.5 U/mg,半失活温度(T5015)为47.2℃,在50℃的半衰期(t1/2,50℃)由亲本的1 min延长为2.2 min。与此同时,通过同源建模获得EGF的三维结构模型,采用半理性设计手段,对通过多序列比对找到的功能热点进行模拟突变,根据突变结果选择了八个位点进行定点突变并构建突变子,经实验验证,获得一个稳定性提高的突变体3G(A227V),它的比酶活为 654.9 U/mg,T5015提高了4.6℃,t1/2,50 ℃延长了3.3 min。利用定点突变,将A411V与A227V两个突变组合,得到了组合突变子2/3G(A411V/A227V),其比酶活为 642.0 U/mg,T5015 提高了约 7.6 ℃,t1/2,50℃ 超过了 768 min,t1/2,52℃ 达到30.4min,说明这两个突变点对蛋白质热稳定性的影响可以叠加。接着,通过对三维结构的刚性分析确定了可能对酶的稳定性具有重要影响的十个氨基酸残基位点,以突变酶2/3G为亲本构建了十个定点饱和突变文库,从E175位点饱和突变文库中筛选到了一个正向突变体175G(A411V/A227/E175K),其比酶活为 697.0 U/mg,T5015 从 52.4 ℃ 升到了 54.6 ℃,t1/2,52℃ 从 30.4 min 延长到了 1302 min,t1/2,50℃更是超过了 2700min。酶学性质研究表明,作为亲本的EGF的最适反应温度为30 ℃,最适反应pH值为6.6;突变酶175G的最适反应温度较EGF提高了 10℃,达到了 40℃,最适反应pH值由6.6变为7.0。接下来,以EEF为亲本,采用易错PCR构建了有效的定向进化突变文库,从中筛选到一个热稳定性提高的突变体7D(P220S),其比活力与亲本酶接近,T5015比亲本酶提高了1℃(达到50.5℃),t1/2,50℃为36.5 min。在此基础上,以突变体7D(P220S)为亲本再次进行定向进化改造,从突变文库中分离得到了热稳定性进一步提高的突变株3D-2(P220S/A280T)其比活力为346.6U/mg,T5o15达到51.5℃,t1/2,50℃比亲本酶延长了 19.4min(达到55.9min)。然而,在后续工作中,不论是采用理性设计方法还是半理性设计方法,都没能获得稳定性进一步提高的EEF突变子。酶学性质分析表明,EEF的最适反应温度为40 ℃,最适反应pH为7.0;突变酶3D-2的最适反应温度较EEF提高了 5 ℃;3D-2的最适反应pH值由7.0变为7.4。比较上述两个分别从EGF和EEF改造得到的突变体可以发现,由EGF改造后得到的突变酶175G的热稳定性比由EEF改造得到的突变酶3D-2更好,前者的T5015比后者高2.8℃。在工业生产L-苹果酸的理想温度(40-60℃)下,175G(A411V/A227/E175K)的比酶活高于3D-2(P220S/A280T)。从食品安全性上考虑,谷氨酸棒状杆菌来源的酶比大肠杆菌来源的酶更易被大众接受,且前者已经被用于L-苹果酸的工业生产,因此,175G(A411V/A227/E175K)更适合被应用于L-苹果酸的工业生产。