论文部分内容阅读
乳腺癌是世界范围内女性发病率最高的恶性肿瘤,近年来发病率逐年上升,据统计,全世界每年约有140万妇女患乳腺癌,有40万妇女死于乳腺癌,在我国发达城市,乳腺癌的发病率也已在女性恶性肿瘤中占据第一位。乳腺癌的治疗已摆脱原先单一的手术治疗模式,取而代之集手术、化疗、放疗、内分泌治疗和靶向治疗为一体的综合治疗模式,因此准确预测乳腺癌患者的预后,并针对性地指导全身辅助治疗,是提高疗效的有效措施。研究发现,肿瘤细胞依赖糖基异常变化逃逸免疫细胞的识别,进而在体内迁移。肿瘤相关糖基结合蛋白Galectin-3是一种半乳糖结合蛋白,广泛表达于正常组织和肿瘤组织中,参与多种生理和病理过程。Galectin-3氨基末端结构域由12个氨基酸组成,包含丝氨酸磷酸化位点,可以调节其细胞靶向；其类α-胶原序列由110个氨基酸组成,可作为基质金属蛋白酶的底物；其羧基末端结构域由130个氨基酸组成,包含碳水化合物识别结构域(carbohydrate-recognition domain, CRD),对β-半乳糖残基有特殊亲和力。Galectin-3在调解细胞生长与分化、机体免疫、细胞黏附、炎症反应、细胞凋亡、血管侵袭等诸多方面起着重要的作用。目前,在许多恶性肿瘤中都发现了Galectin-3的表达,在一些肿瘤中,Galectin-3表达增高伴随着肿瘤的进展。Shalom等发现通过转染Galectin-3反义寡核苷酸或反义cDNA使细胞系Galectin-3表达受抑制,则人类乳腺癌细胞的生长受到明显抑制；Miyaaki等发现具有腹膜转移能力的胃癌细胞系中Galectin-3高表达,而在无腹膜转移潜能的胃癌细胞系中表达很低；Jonkman等认为头颈腺样囊性癌中Galectin-3的表达情况与局部转移和远处转移明显相关。大量的研究显示Galectin-3在肿瘤细胞株中发挥重要的生物学作用,但用免疫组化方法检测其在乳腺癌组织中表达状况的研究较为罕见。Galectin-3通过与特定信号分子相互作用对肿瘤细胞生长的调控机制尚不十分明确。研究发现Galectin-3高表达激活PI3K/AKT信号转导途径,从而发挥促进细胞运动,抵抗TRAIL诱导的细胞凋亡等作用,两者还可能以不同方式协同参与Ras等信号途径的活化。研究表明PI3K/AKT信号转导通路活性调控失调在多种肿瘤发生机制中发挥着重要作用,磷酸化丝/苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)与乳腺癌相关研究逐渐引起关注,但未见乳腺癌中Galectin-3和p-AKT表达意义及相关性研究的报道。本实验应用免疫组化的方法检测97例乳腺浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma, IDC) Galectin-3及p-AKT蛋白表达情况,并探讨它们在乳腺浸润性导管癌的表达意义和预后关系。材料和方法：收集本院病理科2001年1月～2005年12月诊断为乳腺浸润性导管癌的存档组织蜡块,术前均未接受任何化疗和放疗。每例均有详细临床资料、手术记录及随访结果,随访采取信访结合电话的方式,随访截止到2009年9月30日,随访时间为17～112个月。患者年龄32～90岁,平均年龄57.5岁,中位年龄59岁。标本均经4%中性甲醛固定。按经Elston和Ellis改良的Bloom and Richardson(1957)提出的评分标准进行组织学分级,Ⅰ级(高分化)21例,Ⅱ级(中分化)47例,Ⅲ级(低分化)29例；按TNM分期,Ⅰ期29例,Ⅱ期49例,Ⅲ期19例；有淋巴结转移者60例,无淋巴结转移37例；在随访期间有35例病例出现骨、内脏器官病灶伴有胸壁、浅表淋巴结转移灶,经病理细胞学或组织学证实为乳腺癌转移死亡,有62例仍存活。20例乳腺腺病为同期外检标本。采用免疫组化EnVision二步法。切片常规脱蜡至水,切片厚度为4μm,高温高压抗原修复,3%过氧化氢消化10分钟,以消除内源性过氧化物酶,滴加一抗于组织切片上,37℃温箱孵育1小时,PBS液漂洗三次,加二抗EnVision复合物37℃温箱孵育半小时,PBS液漂洗,DAB显色,苏木精复染,脱水,透明,封片,镜检。Galectin-3兔抗人多克隆抗体购自北京中杉生物技术公司,工作浓度为1：100,p-AKT (THr308)兔抗人多克隆购自Santa Cruz公司,工作浓度为1：200,二抗EnVision system购自DAKO公司。Galectin-3蛋白阳性部位主要在细胞浆,少量表达细胞核,以出现棕黄色颗粒且染色强度高于背景非特异性着色者为阳性细胞,p-AKT以胞核着色为主,部分胞浆着色。双盲法观察免疫组化结果,采用IP (Intensity X Percentages)评分方法,综合考虑染色强度和阳性细胞数：(1)染色强度记分：无染色或与背景非特异性着色一致者记0分,淡黄色及棕黄色记1分,棕褐色记2分；(2)阳性细胞数记分：无阳性细胞记0分,阳性细胞数小于50%记1分,阳性细胞数大于50%记2分。根据两项分数乘积判断阳性等级：阴性：0分；阳性：1、2、4分(1分：低表达；2分：中等表达；4分：高表达)。应用SPSS 17.0软件包进行统计学处理,不同组的比较采用卡方检验,P<0.05被认为有显著性差异,Galectin-3和p-AKT的相关性分析采用Spearman相关分析。Galectin-3主要表达于癌细胞的细胞浆,p-AKT则以胞核着色为主,部分胞浆着色,阳性染色呈棕黄色细颗粒状。97例乳腺IDC有82例表达Galectin-3,阳性率为84.5%,低表达42例,占51.2%中等表达和高表达40例,占48.8%；75例表达p-AKT,阳性率为77.3%,低表达42例,占56.0%,中等表达和高表达33例,占44.0%；而Galectin-3和p-AKT在20例腺病中的阳性表达率分别为25%(5/20),30%(6/20),且都为低表达,Galectin-3和p-AKT在乳腺IDC及乳腺腺病的表达具有显著性差异(P<0.05)。Galectin-3在死亡组中的阳性率为97.1%(34/35),在存活组中的阳性率为77.4%(48/62),p-AKT在死亡组中的阳性率为91.4%(32/35),在存活组中的阳性率为69.4%(43/62),差异具有统计学意义,P<0.05。Galectin-3在淋巴结转移阳性组中的阳性率为86.7%(52/60),在淋巴结转移阴性组中的阳性率为81.1(30/37),无显著性差异(P>0.05)；p-AKT在淋巴结转移阳性组中的阳性率为88.3%(53/60),在淋巴结转移阴性组中的阳性率为59.6(22/37),差异具有统计学意义(P<0.01)。Galectin-3和p-AKT的表达与乳腺IDC患者的年龄相关,而与组织学分级、TNM分期无关。在97例乳腺IDC中,Galectin-3和p-AKT同时表达阳性的有72例,占74.2%,Galectin-3和p-AKT同时表达阴性的有12例,占12.4%,两者表达不一致共13例,占13.4%。Spearman相关分析发现,Galectin-3和p-AKT在乳腺IDC组织表达呈正相关(r=0.606,P<0.05),Kappa-致性分析认为两个指标具一致性。本实验得出以下结论：(1)Galectin-3和p-AKT在乳腺IDC中表达明显增高,提示它们在乳腺组织癌变过程中起一定作用。(2)Galectin-3和p-AKT在淋巴结转移组中阳性表达率增高,提示它们可能参与乳腺IDC的转移机制。(3)Galectin-3和p-AKT在死亡组中表达明显高于存活组,提示它们与乳腺IDC的预后差呈正相关。(4)Galectin-3和p-AKT在乳腺IDC组织中表达呈正相关,说明它们可能以某种方式协同参与肿瘤的发生进展。