【摘 要】
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普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）是一类特异性催化支链淀粉、普鲁兰多糖及极限糊精等多糖聚合物的α-1,6-糖苷键水解的脱支酶。目前,作为淀粉制糖的关键酶制剂,耐酸耐高温特性的普鲁兰酶已被广泛应用于高品质糖浆的生产过程。然而,淀粉加工业中对普鲁兰酶的要求已不仅仅停留在传统地利用耐酸性普鲁兰酶进行高糖浆的制备,还着眼于寻求酶学性质多样化的普鲁兰酶来生产更多具有高附加值的产物。耐热芽孢杆菌（Bacill
【基金项目】
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国家自然科学基金项目“基于多结构域和柔性结构特征的普鲁兰酶识别淀粉分支结构的分子机制与性能调控”,项目编号 31872891；
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普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）是一类特异性催化支链淀粉、普鲁兰多糖及极限糊精等多糖聚合物的α-1,6-糖苷键水解的脱支酶。目前,作为淀粉制糖的关键酶制剂,耐酸耐高温特性的普鲁兰酶已被广泛应用于高品质糖浆的生产过程。然而,淀粉加工业中对普鲁兰酶的要求已不仅仅停留在传统地利用耐酸性普鲁兰酶进行高糖浆的制备,还着眼于寻求酶学性质多样化的普鲁兰酶来生产更多具有高附加值的产物。耐热芽孢杆菌（Bacillus thermoleovorans US105）来源的普鲁兰酶（BtPul）为中性嗜热普鲁兰酶,其在pH 6.0、70℃的条件下酶活水平最高,为219.2 U/mg,有望应用于淀粉原料的高值化等领域。然而,野生型BtPul的热稳定性与淀粉加工业的应用要求尚有差距。本论文基于BtPul的序列和结构信息,借助计算设计提高BtPul的热稳定性。此外,应用化学试剂进一步提高BtPul的活性和热稳定性,并通过在BtPul的N-末端融合信号肽的方式提高其在E.coli系统中的分泌效率。主要研究结果如下:（1）基于传统的定点突变,结合多种热稳定性计算工具（FoldX、dDFIRE和I-Mutant 3.0）的组合预测对BtPul进行热稳定性改造。通过组合上述3种热稳定性计算工具预测了17个潜在的稳定突变体,并进行了系列突变体的构建。突变体S25E、D138F、P207W、C691R、G692M和T694F的Tm值提高了1.1-3.8℃不等。它们的半衰期分别为178 min、173 min、187 min、202 min、265 min和210min,分别是WT的1.39倍、1.35倍、1.46倍、1.58倍、2.07倍和1.64倍。G692M为最优突变体,其比活等酶学性质几乎未受突变的影响。（2）基于非传统的定点突变,将非标准氨基酸O-2-溴乙基酪氨酸（O-2-bromoethyl-tyrosine,O2be Y）引入并“装订”BtPul的N/C末端结构域,从而提高BtPul的热稳定性。根据Rosetta Match、FoldX、和Rosetta ddg＿monomer对潜在的稳定“装订”位点的设计结果,共构建了8个突变体。单突变体T73（O2be Y）-171C的半衰期为330 min,是野生型的2.57倍,Tm提高了7.0℃。组合突变体T73（O2be Y）-171C/T126F和T73（O2be Y）-171C/T126F/A72R的半衰期分别为425min和398 min,是野生型的3.32倍和3.11倍。此外,两组合突变体的比活也分别提高至282.9 U/mg和316.6 U/mg。动力学参数的测定结果显示,两者的Km分别降低至6.47±0.2 mg/mL和4.9±0.2 mg/mL,kcat/Km分别提高至88.2±4.9 mL/mg/s和85.5±5.3 mL/mg/s。（3）应用化学试剂提高突变酶的活性和热稳定性。考察了几种常见的化学试剂对BtPul活性和热稳定性的影响:Mn2+、Mg2+和曲拉通X-100对酶活有较大的激活作用,其添加分别使相对酶活提高105.1%、95.7%和78.0%。Mg2+、麦芽糖以及明胶对酶热稳定性有比较大的促进作用,其添加分别使360 min时的残余酶活提高12.0%、38.0%和49.0%。Cu2+的加入使BtPul的残余酶活提高至49.5%,但其相对酶活降低至仅为14.2%。（4）提高突变酶在E.coli系统中的分泌效率。信号肽融合突变体PelB-G692M胞外酶活提高至4.8 U/mL,是G692M的2.4倍,其胞外酶活/总酶活是G692M的9.7倍。PelB密码子优化后的突变体OptPelB-G692M的胞外酶活提高至29.8 U/mL,是PelB-G692M的6.2倍,是G692M的14.9倍。OptPelB-G692M的总酶活从50.0 U/mL提高至160.0 U/mL,胞外酶活/总酶活也从9.6%提高至18.6%。
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