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目的:探讨没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对凝血因子Ⅶa及蛋白酶激活受体2激动剂(PAR2-AP)诱导的结肠癌细胞株SW620增殖与迁移的干预作用;进一步分析EGCG干预作用的相关分子机制。
方法:(1)采用一定浓度EGCG、PAR2-AP、凝血因子Ⅶa等不同组合处理SW620细胞,流式细胞仪检测细胞周期时相分布,MTT法检测细胞增殖,Transwell法检测细胞迁移能力,分析EGCG对Ⅶa及PAR2-AP诱导的SW620细胞增殖与迁移效应的阻断作用。(2)激光共聚焦显微镜观察细胞骨架的改变,分析PAR2-AP、因子Ⅶa对SW620细胞骨架的影响,并观察EGCG对此有无阻断作用。(3)分别采用荧光定量PCR、Western blotting、TF活性测定试剂盒及ELISA试剂盒检测上述不同组合处理的细胞表达组织因子(TF)、半胱氨酸蛋白酶7(Caspase-7)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的水平,分析EGCG是否干预Ⅶa及PAR2-AP对细胞表达相关效应分子的调节作用。(4)利用Western blotting进一步检测上述不同组合处理的细胞内ERK1/2磷酸化水平、NF-κB抑制蛋白(IκB-α)、细胞核NF-κB(p65/RelA)的蛋白水平变化,探讨EGCG对Ⅶa及PAR2-AP诱导细胞增殖迁移的干预作用的分子机制。
结果:(1)EGCG(100μg/mL)可抑制因子Ⅶa(10 nmol/L)对SW620细胞S期比率的升高作用;抑制PAR2-AP(100μmol/L)及Ⅶa对细胞增殖、迁移的促进作用。(2)EGCG(100μg/mL)能够削弱PAR2-AP及Ⅶa引起的SW620细胞骨架重组与丝状伪足的形成。(3)EGCG(100μg/mL)能够显著降低PAR2-AP及Ⅶa对SW620细胞表达TF(mRNA及活性)、MMP-9(活性)的促进作用,以及对Caspase-7(mRNA及蛋白)表达的下调作用。(4)EGCG呈剂量依赖性地抑制Ⅶa对SW620细胞ERK1/2磷酸化的增强作用,阻断Ⅶa对IκB-α及核NF-κB(p65/RelA)表达的调节作用。EGCG(100μg/mL)同时阻断PAR2-AP对ERK1/2磷酸化、IκB-α、核NF-κB(p65/RelA)表达的调节作用。
结论:(1)茶多酚EGCG显著抑制因子Ⅶa及PAR2-AP诱导SW620细胞增殖与迁移的作用,并直接削弱Ⅶa及PAR2-AP对细胞骨架蛋白的排列及丝状伪足生成的促进作用。
(2)EGCG阻断因子Ⅶa及PAR2-AP对SW620细胞TF、MMP-9、Casigase-7等效应分子表达的调节作用,是其干预Ⅶa及PAR2-AP促进SW620细胞增殖与迁移的主要靶点。
(3)EGCG阻断因子Ⅶa及PAR2-AP对SW620细胞ERK1/2磷酸化及IκB-α/NF-κB通路的激活作用,可能是其干预Ⅶa及PAR2-AP促进SW620细胞增殖与迁移的重要途径。