论文部分内容阅读
产毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起婴幼儿、哺乳动物腹泻的重要病原菌。ETEC分泌的不耐热性肠毒素（Heat-labile enterotoxin，LT）是其致幼龄动物腹泻的主要致病因子。LT是由LTA、LTB两种亚单位组成的六聚体，LTA为LT的毒性部位，LTB为LT的受体结合部位。许多研究表明，LT作为一种常见的黏膜免疫佐剂，其LTA和LTB均有较强的黏膜免疫佐剂活性，单独与其他抗原同时使用时，均可刺激机体产生较强的体液与细胞免疫应答，但LTA的毒性限制了其以及LT在临床上的应用，因此构建相应的减毒突变体成为研究其佐剂功能的趋势。研究发现，LTA和LTB发挥黏膜佐剂作用的机制是不同的，提示两者可以同时使用，这为增强佐剂的活性提供了一定的可能性。本研究根据GenBank上发表的LTA和LTB的基因序列设计特异性引物，首先从ETEC菌株cvcc230的基因组中扩增到了LTA成熟肽基因，并采用重叠延伸PCR技术，将第63位编码丝氨酸（Ser）的密码子TCT突变成编码赖氨酸（Lys）的密码子AAA，构建了LTAK63和LTAK63t（t代表终止密码子TAG）突变体，从重组质粒pPG-2-LTB上扩增到LTB成熟肽基因与含LTB成熟肽、pPG-2载体自身核糖体结合位点（RBS）和信号肽序列（ssUSP）的RBS-ssUSP-LTB基因，命名为rsLTB。所有PCR扩增产物克隆到pMD18-Tsimple中，获得阳性重组质粒。然后，构建重组菌pET-28a-LTA/BL21(DE3)pLysS，表达了rLTA蛋白，用纯化的蛋白免疫小鼠制备抗血清，血清ELISA效价可达1:12800，Western Blot结果显示，制备的鼠抗rLTA阳性血清具有很好的特异性。同时，本实验利用纯化的rLTB蛋白作为免疫原免疫6周龄BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞，采用间接ELISA对杂交瘤细胞上清进行LTB抗体检测，对分泌抗体阳性的杂交瘤细胞经多次克隆筛选，最终得到了2株稳定分泌抗LTB抗体的杂交瘤细胞株2F11和4H2。这2株杂交瘤细胞经多次传代证明其具有稳定分泌抗体的能力，抗体亚类鉴定结果均为IgG1类。WesternBlot显示两株单克隆抗体可与具有GM1结合活性的rLTB蛋白发生特异性结合，表明两株单克隆抗体可用于天然LTB的检测，为LTB的检测与应用提供了材料。将获得的基因片段LTAK63和LTB经酶切后插入到分泌表达载体pPG-2上，构建了两种基因的融合表达载体pPG-2-LTAK63-LTB；将获得的基因片段LTAK63t和rsLTB经酶切后插入到分泌表达载体pPG-2上，构建了两种基因的共表达载体pPG-2-LTAK63t-rsLTB。将构建的重组质粒pPG-2-LTAK63-LTB和pPG-2-LTAK63t-rsLTB分别电转化至干酪乳杆菌L.casei393，得到重组分泌融合表达型干酪乳杆菌pPG-2-LTAK63-LTB/L.casei393和重组分泌共表达型干酪乳杆菌pPG-2-LTAK63t-rsLTB/L.casei393。用1%的乳糖诱导两种重组菌，Western Blot检测目的蛋白的表达。Western Blot检测结果表明重组菌pPG-2-LTAK63-LTB/L.casei393经诱导后有约38kDa的融合蛋白表达，重组菌pPG-2-LTAK63t-rsLTB/L.casei393经诱导后有约27kDa和11kDa的目的蛋白分别表达。将7周龄的40只BALB/c小鼠随机分成4组，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组在灌胃诱导后的模式抗原重组菌pPG-2-FaeG/L.casei393的同时，分别灌胃诱导后重组菌pPG-2-LTAK63-LTB/L.casei393、pPG-2-LTAK63t-rsLTB/L.casei393、pPG-2/L.casei393，Ⅳ组只灌胃诱导后的重组菌pPG-2/L.casei393作为载体对照组。分别于首次免疫前和首次免疫后的第7d、14d、21d采集各组小鼠血液、收集小鼠的外生殖道、鼻腔冲洗液，于首次免疫前和首次免疫后隔天收集各组小鼠新鲜粪便，分别检测各组小鼠的血清中特异性抗体水平和黏膜抗体水平；于首次免疫后28d，采用MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况；首次免疫后28d，每组剩余小鼠灌胃致死剂量的K88+ETEC菌株菌液。结果表明，不同形式表达的LTAK63蛋白和LTB蛋白对提高小鼠抗FaeG的血清IgG水平和黏膜sIgA水平均有一定的作用，且LTAK63蛋白和LTB蛋白共表达后呈现出的佐剂活性高于融合表达；攻毒试验结果表明，配同灌胃表达佐剂的重组菌后，小鼠对K88+ETEC菌株产生了较强的免疫保护作用。以上结果证实，本实验构建的重组菌在配同模式抗原重组菌免疫小鼠后，对小鼠的体液免疫应答和细胞免疫应答均起到了一定的增强作用，说明构建的重组菌呈现出了一定的黏膜佐剂活性，为新型黏膜佐剂的研究奠定了基础。