油藏环境是一个极端环境,发育着丰富的微生物,其中硫酸盐还原菌代谢产生的硫化氢会引发油藏管道的腐蚀和油藏酸化等一系列问题,给采油工业带来巨大的经济损失。而硝酸盐还原菌对硫化氢的抑制作用,能减轻或缓解上述问题。目前,关于油藏环境中硫酸盐还原菌和硝酸盐还原菌的分布及相互作用研究是本领域的一个热点。本文采用分子生物学方法研究了不同温度油藏环境中硫酸盐还原菌和硝酸盐还原菌的菌群组成及分布特征,探讨了硝酸盐扰动对硫酸盐还原菌与硝酸盐还原菌菌群组成的影响,分离获得了一株油藏产出液中的优势硝酸盐还原菌,结合化学与生物分析的方法评价该菌对硫酸盐还原菌的抑制效果。本文的研究结果丰富了对油藏环境中硫酸盐还原菌与硝酸盐还原菌多样性的认识,拓展了硝酸盐还原菌功能基因在油藏环境中的应用,为进一步通过生态调控方法对抑制硫酸盐还原菌进而解决设备腐蚀与油田酸化问题的研究提供理论基础。针对不同温度油藏(21℃至95℃)环境样品,采用16S rRNA基因克隆文库和异化亚硫酸盐还原酶功能基因(dsrAB)克隆文库的方法研究了微生物群落结构,结果表明,中低温油藏产出液中的优势硫酸盐还原菌主要属于Desulfovibrio、Desulfomicrobium和Desulfotomaculum;而高温油藏(89℃)产出液中检测到5个目(Desulfovibrionales、 Desulfobacterales、Syntrophobacterales、Clostridiales和A rchaeoglobales)共13种SRP,其中的优势硫酸盐还原菌为Desulfovibrio、Desulfomicrobium和Desulfotomaculum;不同温度油藏硫酸盐还原菌的分布特征具有显著差异,嗜热硫酸盐还原菌主要分布在高温油藏中,嗜温硫酸盐还原菌广泛分布在中低温油藏；同时发现,相比于用16S rRNA基因通用引物,16S rRNA特异性引物和dsrAB功能基因引物能够获得较丰富的硫酸盐还原菌菌群多样性信息。典型对应分析(CCA)表明,Desulfotomaculum的分布与SO42-、乙酸和丙酸浓度呈正相关,Desulfobacter和Desulfobulbus与单质硫浓度呈正相关,Desulfobacter与盐度和乙酸盐的浓度呈正相关,本结果进一步证实,在油藏环境中SRP以乙酸和丙酸等小分子酸为碳源,通过生长代谢还原硫酸盐。本文采用dsrAB功能基因检测油藏环境硫酸盐还原菌的方法有助于认识油藏微生物中硫酸盐还原菌的分布及多样性,从而为有效控制硫酸盐还原菌提供参考。采用硝酸盐还原酶功能基因inarG和napA)和亚硝酸盐还原酶功能基因(nirS、 nirK和nrfA)克隆文库的方法分析了5个油田共25个不同温度油藏(21℃至95℃)环境样品中的硝酸盐还原菌菌群组成,结果表明,其中硝酸盐还原菌的类型包括：Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria和Cyano bacteria;napA功能基因共检测到的硝酸盐还原菌类型包括：a-proteobacteria、β-proteobacteria、γ-proteobacteria、ε-proteobacteria;而narG功能基因检测到更丰富的硝酸盐还原菌类型,包括：α-proteobacteria、β-proteobacteria、γ-proteobacteria、ε-proteobacteria、 δ-proteobacteria、Bacilli、Actinobacteria以及古菌Methanomicrobia和Archaeoglobi; nirK和nirS功能基因检测到的硝酸盐还原菌类型有:α-proteobacteria、β-proteobacteria、 γ-proteobacteria、Cyanobacteria和Bacteroidia; nrfA功能基因检测到的硝酸盐还原菌类型主要为Bacteroidia。表明本文检测的样品中含有周质硝酸盐还原酶功能基因的微生物大多属于Proteobacteria;而含有膜结合硝酸盐还原酶功能基因的微生物类型更丰富,有Proteobacteria、Firmicutes和Euryarchaeota;含有亚硝酸盐还原酶功能基因的微生物类型除Proteobacteria外主要为Bacteroidia;阐明不同类型的硝酸/亚硝酸盐还原菌中所含的反硝化功能基因不同。典型对应分析(CCA)表明,油藏环境中的小分子酸、N03-、Cl-和pH值等环境因子在很大程度上影响了不同类型硝酸盐还原菌的分布。采用功能基因文库分析的方法,研究了硝酸盐对硫酸盐还原菌与硝酸盐还原菌菌群组成的影响。dsrAB功能基因克隆文库分析结果表明,除加硝酸盐前的基线样品中检测到4种类型的硫酸盐还原菌外,之后采集的样品中都未检测到dsrAB功能基因,说明硫酸盐还原菌的生长代谢受到抑制,其在样品中的丰度降低至检测限以下。napA功能基因克隆文库分析结果显示,加硝酸盐之前的基线样品中检测到的硝酸盐还原菌有Rhodopseudomonas、Pseudomonas和Stappia,其中Rhodopseudomonas为优势菌(占总克隆数的50%,下同)；连续注入硝酸盐6个月后的产出液样品中检测到的硝酸盐还原菌为Rhodopseudomonas;停注硝酸盐1个月后采集的产出液样品中NRB菌群组成变为Sulfurimonas、Sulfurospirillum和Pseudomonas,其中Sulfurimonas和Sulfurospirillum各占总克隆数的44%。narG功能基因克隆文库分析结果显示,基线样品中硝酸盐还原菌菌群比较丰富,包括：Castellaniella、Pseudomonas、Comamonas、 Thiobacillus和Geobacter,其中Pseudomonas为优势菌(57%)；注硝酸盐6个月后narG功能基因多样性变得比较单一,只检测到Denitromonas;停注硝酸盐1个月后采集的产出液样品中检测到Pseudomonas和Denitromonas,其中Denitromonas(70%)为优势菌。nrfA功能基因克隆文库分析结果显示,硝酸盐还原菌菌群组成从基线样品中的Parabacteroides转变为Thauera,最后所采产出液样品中只检测到Geobacter。在停注硝酸盐1个月后采集的样品中检测到NR-SOB:Sulfurimonas和Sulfurospirillum,该类微生物可以还原硝酸盐并能将硫化物氧化为单质硫等无毒形式的硫,进而减少和缓解因硫化物引起的酸化及腐蚀。说明硝酸盐的干扰能降低油藏中硫酸盐还原菌的丰度,改变硝酸盐还原菌的菌群组成。从油田产出液样品中分离得到一株能够有效抑制硫酸盐还原菌的硝酸盐还原菌IB1。经鉴定该菌属于Pseudomonas。通过代谢产物检测、挂片失重实验和PCR-DGGE等分析研究表明,IB1与硫酸盐还原菌共存15天后对硫化氢的抑制率达99.06%;IB1菌使混合培养体系对钢片的腐蚀速率降低了71.5%；DGGE分析表明混合培养后SRP特征条带减弱甚至消失。可见,IB1菌对SRP生长代谢产硫化物的活性具有抑制作用。本研究对象为不同温度油藏环境样品,硫酸盐还原菌与硝酸盐还原菌的菌群组成分析及其受硝酸盐干扰的影响与二者间的相互作用等研究成果丰富了对油藏环境中硫酸盐还原菌与硝酸盐还原菌多样性的认识,拓展了硝酸盐还原菌功能基因在油藏环境中的应用,在通过生态调控方法抑制硫酸盐还原菌进而缓解设备腐蚀与油田酸化的基础理论和实际应用方面具有重要的价值。