论文部分内容阅读
目的：
本实验前期已明确钩虫抗凝肽AcaNAP9具有显著体外抗凝活性,可能开发为抗凝抗栓新药。本论文通过在大肠杆菌中制备重组钩虫抗凝肽rAcaNAP9,并对rAcaNAP9进行急性毒理学实验及初步药效学实验,将为AcaNAP9的应用提供依据。
方法：
1.重组钩虫抗凝肽rAcaNAP9的原核表达
将构建好的重组质粒pET32a/AcaNAP9转化至大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达。6-His亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE分析纯化效果。纯化的重组蛋白经凝胶过滤层析除咪唑,内毒素亲和吸附除内毒素后,用体外凝血酶原时间(PT)检测体外抗凝活性。
2.重组钩虫抗凝肽rAcaNAP9的急性毒性实验
将20只KM小鼠随机分为2组。其中一组设为空白对照组,一次性按照0.2ml/10g体重iv给生理盐水。另一组设为给药组,一次性按照0.2ml/10g体重iv给药12.67mg/mlAcaNAP9。给药后,记录3周时间内所有KM小鼠的生存状况,之后处死所有小鼠,并进行尸检。
3.重组钩虫抗凝肽rAcaNAP9的药效学实验
将55只SD大鼠随机分为rAcaNAP9低剂量组(40μg/kg)、中剂量组(200μg/kg)、高剂量组(1mg/kg)、肝素组(肝素钠,1650U/kg)和模型对照组共5组。分离大鼠一侧颈总动脉,从鼠尾静脉iv给药后,立即用血栓生成仪对颈动脉进行恒流直流电刺激5min,检测受刺激血管的堵塞程度,并对各组电刺激5min后颈动脉堵塞程度的差异进行统计学分析。
结果：
平均100mlLB培养基可获得25.43mg可溶性rAcaNAP9,测得rAcaNAP9体外抗凝活性为100nM rAcaNAP9延长约5倍PT;在给药后3周的观察时间内,所有受试KM小鼠均存活且无任何异常表现,处死后尸检结果正常;在大鼠颈总动脉血栓形成实验中,rAcaNAP9低、中剂量组颈动脉堵塞程度和模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05),rAcaNAP9高剂量组颈动脉堵塞和模型对照组比较有极其显著性差异(P＜0.01);rAcaNAP9低、中剂量组颈动脉堵塞程度和肝素组比较无显著性差异(P＞0.05),rAcaNAP9高剂量组颈动脉堵塞和肝素组比较有显著性差异(P＜0.05)。
结论：
本实验中平均100mlLB培养基可获得25.34mg可溶性rAcaNAP9,实现了重组钩虫抗凝肽rAcaNAP9在大肠杆菌中高效、可溶性表达;所有受试KM小鼠在一次性接受了253.4mg/kg剂量的rAcaNAP9后三周内均存活且无任何异常表现。处死后尸检结果正常。证明重组钩虫抗凝肽rAcaNAP9是一种毒性非常小、安全性较高的多肽;在大鼠颈总动脉血栓形成实验中,rAcaNAP9低、中剂量组颈动脉堵塞程度和模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05),rAcaNAP9高剂量组颈动脉堵塞和模型对照组比较有极其显著性差异(P＜0.01);rAcaNAP9高剂量组颈动脉堵塞和肝素组比较有显著性差异(P＜0.05),证明rAcaNAP9是一种抗凝作用明显的多肽,可作为抗凝抗栓新药进行开发。