论文部分内容阅读
棉花作为主要的棉纺织工业原料,是我国重要的经济作物之一。多种非生物胁迫(如干旱、高温等)严重影响了我国棉花的生产。WRKY转录因子是高等植物特有的转录因子,广泛参与调控植物对多种环境胁迫的应激反应。然而,由于功能的复杂性,WRKY转录因子在棉花抗逆过程中的作用还不清楚,其调控植物抗逆反应的分子机制仍需进一步阐明。本实验从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)(鲁棉研22)中分离出一个Ⅱd族WRKY转录因子家族成员,GhWRKY21。利用生物信息学、分子生物学、生物化学等技术,明确了GhWRKY21在调控棉花非生物胁迫抗性方面发挥的重要作用,解析了GhWRKY21调控棉花抗旱性的分子机制。主要结果如下:(1)GhWRKY21基因cDNA全长1494 bp,包含173 bp的5’非编码区、324 bp的3’非编码区和996 bp的开放阅读框(ORF)。ORF可以编码一个含331个氨基酸残基的多肽,其分子量约为36.8 kDa,等电点为9.51。多序列比对及进化树分析显示,GhWRKY21是典型的Ⅱd族WRKY转录因子家族成员。(2)亚细胞定位结果显示GhWRKY21特异性的定位在细胞核中。表达特性分析发现GhWRKY21在棉花根、茎、叶中均有表达,表达水平可受到干旱、高温等非生物胁迫,脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(JA)等信号分子的诱导。(3)利用病毒介导的基因沉默技术(virus-induced gene silencing,VIGS)获得了GhWRKY21沉默的棉花植株。功能分析发现,沉默GhWRKY21显著提高了棉花对干旱和高温胁迫的耐受力,使棉花叶片受损伤程度明显下降。(4)利用农杆菌介导的叶盘转换法得到了超表达GhWRKY21的转基因烟草,通过对转基因烟草在干旱胁迫下的发芽率、存活率、失水率和气孔开度等指标的测量以及表型分析,发现超表达GhWRKY21降低了转基因植株的抗旱性。此外,在添加ABA合成抑制剂后,超表达GhWRKY21的转基因烟草在干旱胁迫下种子的萌发率和萌发后的根长与野生型相比,没有显著差异。因此,GhWRKY21调控棉花对干旱胁迫的响应是依赖ABA的。(5)通过对ABA信号通路中所有A型PP2C蛋白磷酸酶的启动子元件分析,得到GhWRKY21可能调控的候选基因。酵母单杂交和EMSA实验结果表明,GhWRKY21可以直接与GhHAB启动子中的W-box结合。荧光定量分析表明,在棉花中超表达GhWRKY21可以促进GhHAB的转录水平,而沉默GhWRKY21后,棉花中GhHAB的表达水平显著降低。以上结果表明,GhWRKY21通过调控GhHAB的表达,负调节ABA介导的抗旱性。(6)通过对高温处理下,超表达GhWRKY21转基因烟草种子的萌发率和幼苗期相关生理指标的分析,发现超表达GhWRKY21降低了转基因烟草对高温胁迫的耐受性,同时转基因烟草中热激相关基因的表达水平显著下降。以上结果说明,GhWRKY21可能通过影响热激相关基因的表达水平调节植物的耐热性。