通关藤Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Am.为萝藦科牛奶菜属植物,以藤茎入药,具有清热解毒,止咳平喘的作用,用于喘咳痰多,产后乳汁不通,风湿肿痛,疮痈等。现代药理试验证明,通关藤还具有抗肿瘤、抗菌、降压、保肝利尿及调节免疫力等多种的作用,尤其是其对肺癌、肝癌有一定的疗效通。通关藤广泛分布于亚洲的热带和亚热带地区,我国主分布于云南、贵州、四川、广西等地,为傣族、苗族、壮族常用药物。近年,以通关藤为原料的消癌平注射液、消癌平颗粒、通关藤饮片的市场需求剧增,通关藤药材的使用量越来越大,使得通关藤原料供不应求。通关藤一般需要3-5年才有采收价值,而人们竭泽而渔似的采集,致使通关藤资源日趋匮乏。目前国内外对通关藤的研究主要集中在化学成分、药理作用及临床应用等方面,而对通关藤的种质资源、遗传多样性、转录组方面的研究很少。因此,对野生通关藤进行资源生境调查和遗传多样研究尤为迫切。有关通关藤功能基因的研究也是空白,通过对其转录组进行分析,了解通关藤皂苷的合成途径和参与合成的酶基因,有利于生产出更好的抗肿瘤药物。本研究利用通关藤的野生种质资源,从表观形态、分子生物学、化学成分等方面开展通关藤种质资源的遗传多样性和药材质量研究,分析种内和居群间的遗传关系,揭示其遗传丰富程度,及遗传多样性与药材品质的关系,为通关藤种质资源保护,合理开发利用提供理论依据。另外,通过对通关藤茎和叶的转录组进行测序分析,发掘了大量参与通关藤皂苷生物合成的酶基因,且推测通关藤的皂苷合成途径,为利用生物技术进行化学成分调控和基因克隆提供基础数据。具体研究内容和结果如下：(1)采用文献查阅、实地调查和关键人物访谈等方法,调查了通关藤在云、贵、川、广的地理分布、生境特征、蕴藏量、生长特性等。结果显示,通关藤主要集中分布于滇东南桂西、滇西南、黔西南三个区域,分布范围为N 21°46’～27°16’, E 98°50’E-106°27’,海拔700～1700m。通关藤的生境条件一般为河谷的北岸或东岸山腰(即南坡或西坡),或温暖潮湿的山坡或山麓；多生于喀斯特地形的灌木林中,或生长于乔木植被盖度较小的阔叶林中；通关藤对伴生植物无选择性,攀附物主要为灌木、岩石、小乔木；对生长地的土壤性质要求不严,土壤类型多为红壤、黄壤、暗棕壤、粗骨土,质地是壤土、砂土、砂壤。(2)对不同居群通关藤种质资源的13个表型性状进行分析,结果表明,不同居群的通关藤的有效分枝、株高、茎粗、果实数量上存在显著差异、具有丰富的遗传变异,CV在13.91%-96.67%。对表型性状进行相关性分析,得出株高与茎粗、节间长、有效分枝、叶宽呈极显著正相关,叶片长与叶宽呈极显著正相关,其他指标间也有一定的相关性。环境因子与表型性状的相关性分析,得出海拔、温度与表型性状呈正相关,有利于通关藤生物量的积累。主成分分析结果表明叶宽、叶长、株高、茎粗、节问长为主要变异因子。(3)采用简单重复序列标记ISSR (Inter-simple sequencer repeat)对29个野生通关藤居群进行了遗传多样性水平和遗传结构的分析。结果表明,在物种水平上,多态位点百分率(PPL)为88.15%,Shannon信息指数(I)为0.4158,Nei’s基因多样性指数(He)平均为0.2768,表明在物种水平上具有较丰富的遗传多样性。Nei’s基因分化系数(Gst)为0.4214,基因流(Nm)为0.6865,这表明居群间的遗传变异占总变异的42.14%,而居群内的遗传变异为57.86%,即遗传变异主要来源于居群内,可能由于居群间的地理隔离和无性繁殖等原因导致。采用UPGMA法及PCoA法对29个居群的通关藤进行聚类分析,结果表明通关藤居群基本按照地理、水系特征而分为三大主要类群。(4)根据通关藤转录组数据设计SSR引物,对不同通关藤居群进行遗传学分析,结果表明,在物种水平上,平均期望杂合度(E-Het)为0.4592,平均观察杂合度(O-Het)为0.6321,O-Het略高于E-Het,说明通关藤杂合程度高。shannon多样性指数(I)平均为0.7429,Nei’s基因多样性指数(He)的分布范围在0.2296-0.4999之间,平均He为0.458。平均多态信息含量(PIC)为0.3368,本研究的12个位点均属中度多态性位点。Fis为-0.5542,表明群体内杂合严重。Fst为-0.3412,表明群体间分化程度很小。因流(Nm)变化范围为0.4225-6.2861,各位点基因流的差异很大,平均为2.2047 。 AMOVA分析结果表明引起通关藤遗传变异的主要来源于居群内,变异达71.05%,而其居群间的变异占总变异的28.95%。对29个通关藤居群进行UPGMA聚类分析,可以将29个通关藤居群分为两大类群。对通关藤资源进行遗传结构分析,结果表明在K=2的情况下,分类效果较好,将29个群体可分为2组。EST-SSR的结果与ISSR的分析结果大致相同,但也不完全一致。(5)选取ITS2、psbA-trnH、rbcL三个序列对29个居群的通关藤基因进行比较分析,结果显示,ITS2序列有效分析长度为527 bp, G+C的平均含量为58.4%,总的变异位点数(Vs)为23,其中单核苷酸变异位点(Ss)为9个,简约信息位点(Ps)14个,单核苷酸变异位点(Ss)为9个,简约信息位点(Ps)4个。PsbA-trnH测序得到1247bp有效全长,G+G为55.8%,有单核苷酸变异位点(Ss)为9个,简约信息位点(Ps)7个。ITS2、psbA-trnH和rbcL序列的自展支持率(bootstrap)显示其种内的遗传变异间重叠较多,不能达到区分不同居群通关藤种群的目的,因此并不适合用于通关藤道地性药材鉴别和遗传多样性分析。(6)采用HPLC法测定不同居群通关藤药材中绿原酸的含量,并对不同产地、不同生长年限、不同部位的通关藤药材进行了质量评价。结果表明,建立的通关藤含量测定方法经方法学考察可靠合理；不同产地的通关藤绿原酸含量存在显著差异,绿原酸的含量平均值为0.3243-1.1472%,含量较高的居群为靖西1.1472%,勐腊1.0096%,安龙0.9932%。通关藤根的绿原酸含量比1、2、3年生的茎中绿原酸含量都低,根中绿原酸平均含量仅有0.2512%,通关藤1年生茎中绿原酸平均含量为0.6452%,2年生茎为0.5159%,3年及3年以上为0.3634%,由此看出,随着通关藤年限增长,茎中绿原酸的含量逐渐减少。对通关藤绿酸的含量与环境因子进行相关性分析,结果表明通关藤绿原酸的含量与经度、年均温、年降水量呈正相关,而与纬度、海拔、年日照时数呈负相关。(7)采用HPLC-ELSD测定不同居群通关藤药材中通关藤苷H、通关藤苷I、通关藤苷G的含量,并对不同产地、不同生长年限、不同部位的通关藤药材进行了质量评价。结果表明,不同产地和不同年限、不同部位的通关藤苷的含量存在着较大差异。通关藤H的平均含量为0.052%,通关藤苷I的平均含量为0.098%,通关藤苷G的平均含量为0.0708%。通关藤苷H在根中的含量明显高于茎中的含量,根的通关藤苷H平均含量为：根>≥3年茎>2年生茎>1年生茎；通关藤苷I的含量表现为：≥3年茎>2年生茎>根>1年生茎,3年及3年以上通关藤茎中通关藤苷I的含量最高；通关藤苷G的平均含量表现规律为：2年茎>≥3年茎>1年茎>根。对通关藤苷H、I、G的含量与环境因子进行相关性分析,结果表明通关藤苷H、I、G与经度、年均温、日照时数都呈正相关,但与海拔、年降水量呈负相关。(8)建立了比色法测定通关藤中总皂苷、总酚酸、多糖的含量,并对不同产地、不同生长年限、不同部位的通关藤药材的总皂苷、总酚酸、多糖含量进行了比较分析。结果表明,不同居群通关藤的总皂苷、总酚酸和多糖含量差异明显。总皂苷的含量较高的居群有云南河口8.0389%,四川德昌7.8694%,云南建水7.1739%,含量高的居群是含量低的居群的2.5倍,相差4.8306%的含量。总酚酸含量较高的居群是云南的华宁10.1129%,禄劝9.6767%,蒙自9.4335%,最高与最低相差3.9853%的含量,相差1.65倍。多糖的含量较高的居群有云南镇康15.3441%,西畴13.6943%,广南12.5699%。其中四川德昌总皂苷含量较高,而总酚酸的含量很低,云南蒙自总酚酸的含量较高,其多糖含量就很少,因此,同一居群其化学组分也有很大差异。总皂苷的含量与生长年限呈正相关,即随着年龄的增长,总皂苷的含量就相应增多,而总酚酸和多糖的含量与部位、年限没有太大密切关系。(9)采用Illumina Hiseq 2000高通量测序技术,从通关藤的茎和叶转录组数据中获得73336个contig和65796个Unigene,通过与公共数据库的比对分析,找出27个参与通关藤苷生物和孕烷苷骨架合成的Unigene。使用qRT-PCR技术分析参与通关苷生物合成的六个酶基因SQS、SQLE、CAS、4-MSO、3β-HSD、5β-POR在茎和叶中的表达情况,这6个基因在通关藤的茎和叶中都表达,CAS、SQS、SQLE、4-MSO在叶中的表达量要高于在茎中的表达量,而3β-HSD和5β-POR基因在茎中的表达量要比叶中的高,5β-POR的表达量在茎中比叶高出36.5%。另外,从11911个unigene中开发出15296个SSRs位点,其中二核苷酸类型最丰富,达53.72%,而重复类型中最多的为AT/AT (26.34%),其次AG/CT (21.02%).基于这些序列,使用Primer 3对这些SSRs进行引物设计,成功设计出27,189对引物。