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背景肝癌的治疗手段多样,但是预后仍不理想。远处转移、术后复发严重影响了患者的长期预后。目前认为导致肿瘤转移复发最关键的细胞生物学机制是上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)。EMT已被证实参与了循环肿瘤细胞的形成,是触发肿瘤转移的关键因素,与肿瘤干细胞形成有关,可使肿瘤细胞获得针对化疗、免疫治疗的耐受性。同时在肿瘤细胞EMT的发生过程中,表观遗传学改变,尤其是抑癌基因甲基化失活机制是研究较为广泛的一个。目前有越来越多的证据表明抑癌基因甲基化失活,参与了包括EMT在内的肿瘤发生发展各个阶段的调控,同时这些基因启动子区的异常甲基化也可作为肿瘤的诊断标志物。ACTL6B基因在HCC组织及细胞株中存在异常甲基化,但是该基因甲基化的调控机制,甲基化失活后是否参与肿瘤的转移复发尚缺乏相关研究。第一章 HCC组织及细胞株中ACTL6B基因启动子区CpG岛存在异常甲基化并导致ACTL6B低表达目的:初步研究HCC中ACTL6B基因启动子区CpG岛的甲基化状态,筛选肿瘤特异性CpG岛,探讨启动子区甲基化对基因表达的影响。方法:运用在线软件预测ACTL6B基因启动子区CpG岛,利用亚硫酸氢盐修饰后直接测序(Direct Bisulfite sequencing PCR,DBSP)检测ACTL6B基因启动子去的甲基化状态,通过比对HCC组织及癌旁正常组织中甲基化水平的差异确定肿瘤特异性CpG位点。针对肿瘤特异性CpG位点设计甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation Specific Polymerase-Chain-Reaction,MSP)引物。进一步利用实时定量聚合酶链反应(Real Time Polymerase-Chain-Reaction,RRT-PCR)、蛋白印迹(Western Blot,WB)检测 HCC 组织及细胞株中ACTL6B的表达水平。结果利用BSP技术在HCC组织中检测出高频异常甲基化,通过与癌旁正常组织的测序结果比对发现,-622,-610,-590,-568,-550,-519,-39,-33,-27,-22,-13,-8,+6,+12为肿瘤特异性CpG位点。利用针对肿瘤特异性CpG位点设计的MSP引物检测组织及细胞中ACTL6B基因的甲基化,得到的结果与测序结果一致。TSA、5-Aza联合处理后HCC细胞株中ACTL6B基因甲基化被抑制,mRNA、蛋白表达被恢复。24例HCC组织中ACTL6B基因的mRNA、蛋白表达水平与ACTL6B基因甲基化水平呈负相关。结论在HCC组织及常见HCC细胞株中存在高频的异常甲基化。HCC异常甲基化主要体现在一系列肿瘤特异性CpG位点中。ACTL6B启动子区的异常甲基化导致ACTL6B的mRNA、蛋白低表达。TSA、5-Aza的联合处理可以逆转ACTL6B的甲基化,进而恢复ACTL6B的表达。第二章 ACTL6A/c-Myc相互作用诱导DNMT3a靶向ACTL6B启动子,促进ACTL6B甲基化。目的:研究HCC中ACTL6B基因启动子区CpG岛的甲基化形成的具体分子机制。方法:利用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)技术检测24例HCC样本中ACTL6A的表达水平,分析ACTL6A的表达与ACTL6B甲基化的相关性。利用BSP、MSP技术检测经siRNA干扰表达ACTL6A的细胞株中ACTL6B启动子甲基化的水平,利用RT-PCR、WB技术检测siRNA干扰表达ACTL6A的细胞株中ACTL6B、DNMT3a、DNMT3b、DNMT1的mRNA、蛋白表达水平。检测siRNA干扰表达ACTL6A的细胞株中甲基转移酶(DNA Methyl Transferase,DNMT)的相对活性。利用 BSP、MSP 技术检测经 siRNA干扰表达DNMTs的细胞株中ACTL6B启动子甲基化的水平。荧光素梅报告基因法检测ACTL6A与DNMT3a野生型(DNMT3a wt)或DNMT3a甲基转移活性缺失型(DNMT3a mut)共转染对ACTL6B基因启动子活性的抑制水平。ChIP技术筛选ACTL6A特异性识别的ACTL6B启动子区位点,验证ACTL6A、c-Myc介导DNMT3a结合ACTL6B启动子区的机制。co-IP技术验证ACTL6A、c-Myc、DNMT3a之间的物理结合作用。结果利用IHC技术检测了 ACTL6A在24例HCC组织中的表达水平,结合ACTL6B的甲基化数据分析显示ACTL6A的表达与ACTL6B的甲基化水平成正相关。细胞功能验证表明ACTL6A过表达可促进ACTL6B甲基化。RT-PCR、WB、甲基转移酶活性实验发现ACTL6A过表达并不影响DNMTs的表达量和总体甲基转移酶活性。BSP、MSP检测发现仅在抑制DNMT3a的表达后ACTL6B基因的甲基化得到逆转,mRNA、蛋白表达得到恢复。荧光素酶报告基因法证实DNMT3a通过ACTL6A的协助促进了 ACTL6B的甲基化。ChIP-PCR技术筛选结果显示ACTL6A可能识别结合ACTL6B启动子区的-120～-50区段。ChIP技术发现ACTL6A、c-Myc、DNMT3a均可在ACTL6B基因启动子区富集,而c-Myc表达被抑制后,ACTL6A的富集并不受影响,而DNMT3a的富集被抑制。BSP检测发现c-Myc表达抑制后ACTL6B基因甲基化同时被抑制。Co-IP技术检测发现ACTL6B、DNMT3a、c-Myc之间存在相互结合作用,c-Myc表达抑制后ACTL6A和DNMT3a直接的结合被抑制。结论在HCC中ACTL6A促进ACTL6B基因的甲基化,抑制ACTL6B的表达,这一过程是通过ACTL6A/c-Myc交互并结合DNMT3a,促近DNMT3a靶向ACTL6B启动子区实现的。第三章 ACTL6B通过抑制EMT抑制HCC细胞株的生长和侵袭迁移目的:研究HCC中ACTL6B基因启动子甲基化后对HCC细胞株生物学功能的影响方法:在HCC细胞株中抑制或过表达ACTL6B基因,利用CCK8检测细胞活性、绘制生长曲线。WB技术检测pERK、ERK、p-AKT、AKT表达水平。裸鼠皮下成瘤、小动物活体荧光成像检测移植瘤生长情况。划痕愈合实验、transwell迁移侵袭实验检测ACTL6B表达对HCC细胞株迁移侵袭能力的影响。WB技术检测ZO-1、E-cadherin、Zeb-1、Snail的表达水平。结果绘制细胞生长曲线后显示,在SMMA-7721,SKHep-1、MHCC97-H、MHCC-LM3中恢复ACTL6B的表达后HCC细胞株的生长被抑制,p-ERK、p-AKT表达减少,裸鼠皮下移植成瘤实验结果同样提示ACTL6B的过表达对HCC细胞株的生长具有抑制作用。划痕愈合实验、transwell迁移侵袭实验结果显示ACTL6B过表达后HCC细胞株的迁移侵袭能力均被抑制。WB检测发现ACTL6B过表达后EMT相关标志物表达改变,其中包括E-cadherin、ZO-1 表达增加,Zeb-1、Snail 表达被抑制。结论ACTL6B通过抑制EMT,抑制HCC的生长、迁移、侵袭第四章 ACTL6B基因甲基化与HCC进展相关,具有潜在的诊断、预后价值目的:研究HCC中ACTL6B基因启动子甲基化与HCC临床病理特征之间的关系,探讨HCC组织及术前外周血血清中ACTL6B基因甲基化水平的诊断、预后价值。方法:利用MSP技术分别检测155例HCC组织及癌旁正常组织,以及155例HCC,60例单纯慢性肝炎肝硬化()患者、60例健康志愿者外周血血清游离DNA(cellfreeDNA,cfDNA)中ACTL6B基因启动子的甲基化情况。分析HCC组织中ACTL6B甲基化与肿瘤进展、预后之间的关系。验证血清cfDNA及组织来源基因组中ACTL6B基因甲基化水平的一致性。探讨血清cfDNA中ACTL6B基因的诊断,预后价值,并与AFP的诊断价值进行比较。结果HCC组织中ACTL6B甲基化阳性率为74.2%,癌旁正常组织中甲基化阳性率为9.0%。HCC组织中ACTL6B的甲基化与性别、肿瘤大小、门静脉癌栓、TNM分期有关。外周血血清cfDNA中ACTL6B的甲基化与组织中ACTL6B的甲基化具有较好的一致性。HCC组织和血清cfDNA中ACTL6B的甲基化是HCC患者无病生存、总生存的独立预后因子。以血清cfDNA中ACTL6B甲基化阳性作为诊断标志物区分慢性肝炎肝硬化(Chronic hepatitis cirrhosis,CHC)的总体诊断效能与血清AFP接近,二者联合作为诊断指标可明显提高整体诊断效能(AUC:0.913,95%CI:0.865-0.961,P:5.914E-21)。ACTL6B 甲基化单指标指标无法作为区分I期HCC和CHC的诊断指标,而AFP仍然具有区分I期HCC和CHC的诊断效能,二者联合可略微提升诊断效能(AUC:0.797,95%CI:0.693-0.901,P:1.929E-06)。ACTL6B用以区分III期HCC的诊断效能大大高于AFP,二者作为联合诊断指标具有最大的诊断效能(AUC:0.958,95%CI:0.917-1.000,P:669E-20)。结论HCC组织中ACTL6B基因的甲基化水平与肿瘤的进展有,是HCC肝切除患者术后总生存和无病生存的独立预后因子。患者HCC组织中ACTL6B的甲基化水平和外周血血清cfDNA的甲基化水平具有较好的一致性。外周血清cfDNA中ACTL6B的甲基化具有潜在的诊断和预后价值。