氧是哺乳动物赖以生存的物质基础之一。多细胞生物依靠氧产生能量并维持基本的生命活动。低氧与心肌缺血、癌症等病理状态有密切的联系。然而，低氧也是维持胚胎发育和干细胞微环境等正常的生理状态必不可少的条件之一。在进化过程中，缺氧诱导因子(Hypoxia Inducible Factor，HIF)通过感知氧的利用度而调控细胞的能量代谢。HIF由O2易降解性α亚基和稳定性β亚基形成的异二聚体发挥转录调控功能。HIF1α是生物适应缺氧环境的主调控因子。常氧下也有表达，但很快被降解，只有在缺氧条件下才能稳定表达。研究表明:HIF1α敲除小鼠导致小鼠胚胎期致死，心脏发育严重缺陷。缺氧探针pimonidazole HCL是一种硝基咪唑的化学物，它在缺氧的区域与细胞的活性成分形成加合物，有充分的证据表明2-硝基咪唑缺氧标记pimonidazole HCL和相关抗体(Hypoxia1，HP1)是可靠的正常组织缺氧标志物。目前，国内对小鼠胚胎发育早期心脏的缺氧状态和HIF1α的表达鲜有报道。本课题在蛋白质水平和mRNA水平对HIF1α在心脏发育过程中的表达、分布及其在不同发育期的表达相对水平进行了系统研究。此外，使用缺氧探针pimonidazoleHCL进一步研究了相应胚胎期心脏的缺氧情况并与HIF1α的表达进行了比较。该研究为深入揭示HIF1α在不同胚胎期心脏不同部位的功能提供了理论依据。　　目的:　　1.以pimonidazole HCl为探针，研究不同发育期小鼠胚胎心脏的缺氧的情况，并与HIF1α的表达分布进行比较，为进一步揭示缺氧导致胚胎心脏疾病的致病机理提供依据。　　2.研究在心脏发育过程中不同胚胎期HIF1α蛋白质和mRNA的相对表达水平。　　方法:　　1.获取正常妊娠9.5、10.5、11.5、12.5天C57/B6小鼠，并分为尾静脉注射pimonidazole HCL和未注射两组妊娠小鼠。在解剖显微镜下取出E9.5、E10.5、E11.5、E12.5天小鼠胚胎，对胚胎组织进行脱水、透明、石蜡包埋、连续切片，用免疫组织化学的方法观察HIF1α蛋白在小鼠胚胎心脏中的表达部位和表达水平。使用缺氧探针pimonidazole HCL进一步研究了相应胚胎期心脏的缺氧部位。　　2.获取正常妊娠9.5、10.5、11.5、12.5天C57/B6小鼠，在解剖显微镜下取出E9.5、E10.5、E11.5、E12.5天小鼠胚胎心脏，采用TRIzol Reagent法提取胚胎心脏RNA再通过qRT-PCR方法检测HIF1αmRNA在小鼠胚胎心脏不同发育期的相对表达水平。　　3.获取正常妊娠9.5、10.5、11.5、12.5天C57/B6小鼠，在解剖显微镜下取出E9.5、E10.5、E11.5、E12.5天小鼠胚胎心脏，采用RIPA法裂解液提取HIF1α蛋白后，用Western Blotting的方法检测HIF1α蛋白在小鼠胚胎心脏不同发育期的相对表达水平。　　结果:　　1.观察到小鼠阴道口有阴栓即确认怀孕并开始计算时间（观察到阴栓的当天中午视为E0.5天），得到孕9.5天小鼠27只，孕10.5天小鼠20只，孕11.5天18只，孕12.5天16只。　　2.为检测胚胎心脏缺氧部位，对孕鼠进行尾静脉注射pimonidazole HCL，得到孕9.5、10.5、11.5、12.5天小鼠各5只。解剖注射过pimonidazole HCL妊娠小鼠，得到E9.5天、10.5、11.5、12.5天小鼠胚胎分别为23、33、33、35只;未注射的妊娠小鼠解剖得到E9.5天、10.5、11.5、12.5天小鼠胚胎分别为25、30、37、34只。　　3.免疫组织化学法显示:在E9.5天，pimonidazole HCL抗体(HP1)在此胚胎期，心房和心室的心肌层和内皮层呈现阳性信号，同时，流出道和房室垫中的心肌层和心内膜层也呈现出pimonidazole HCL阳性反应。我们观察到HIF1α在胚胎心脏的心室以及心房的心肌层和心内膜层阳性表达，在流出道和房室垫的心肌层和内膜层也呈阳性表达，并且在房室垫中正在转化成间充质细胞的内皮细胞也表现出阳性结果。　　在E10.5天，HP1在心房的心肌层和内皮细胞呈pimonidazole HCL阳性反应，在心室肌小梁和内皮细胞呈阳性信号，在心内膜垫两侧的心肌细胞和内皮细胞中呈强阳性信号，流出道间充质细胞呈现阴性信号，同时两个心内膜垫的间充细胞也呈现阴性。HIF1α的表达也同样在心房心肌层和内皮细胞中阳性表达，并在心室肌小梁和内皮细胞中阳性表达，HIF1α在流出道和心内膜垫中的间充质细胞的表达则为阴性。　　在E11.5天，HP1在心房心肌细胞和内皮细胞有阳性反应;然而，在左右心室的心肌细胞、肌小梁和内皮细胞呈弱阳性信号;此时的室间隔心肌细胞阳性信号明显，而在心内膜垫间充质细胞未检测到阳性信号。同时我们对HIF1α在此胚胎期的表达检测表明:HIF1α在小鼠胚胎心脏的心房心肌细胞和内皮层呈阳性表达;在左右心室的心肌细胞、肌小梁和内皮细胞表达呈阳性;在心内膜垫间充质细胞未检测到阳性表达。　　在E12.5天，HP1在小鼠胚胎心脏的心房心肌细胞和内皮细胞呈阳性反应;在左右心室的心肌细胞、肌小梁和内皮细胞表呈阳性信号;在心内膜垫呈阴性。同时对此时的胚胎心脏HIF1α检测表明:在心房心肌细胞和内皮细胞中呈阳性表达;在左右心室的心肌细胞、肌小梁和内皮细胞表达也呈阳性;在心内膜垫表达未检测到阳性表达。研究结果提示:HIF1α在心脏中的表达模式与HP1的阳性信号呈现高度一致。　　4.解剖显微镜下操作，将E9.5、E10.5、E11.5、E12.5天小鼠胚胎心脏取出，利用qRT-PCR检测HIF1αmRNA的表达情况，结果显示:HIF1αmRNA的表达在E10.5天最高，E11.5天最低。组间统计学比较:E9.5天的表达量高于E11.5天，差异有统计学意义(P＜0.05);E10.5天的表达量高于E11.5、E12.5天，差异有统计学意义(P＜0.05);E11.5天的表达量低于E12.5天，差异有统计学意义(P＜0.05)，HIF1αmRNA的表达呈现动态表达趋势。　　5.在解剖显微镜下取出E9.5、E10.5、E11.5、E12.5天小鼠胚胎心脏各54、37、37、36个，Western Blotting结果显示:HIF1α蛋白质在E10.5天表达量最多，E11.5天表达量最少。组间统计学比较:在E9.5天的表达量高于E11.5天，差异有统计学意义(P＜0.05);E10.5天的表达量高于E11.5、E12.5天，差异有统计学意义(P＜0.05)，HIF1α蛋白表达呈现动态表达趋势。　　结论:　　在不同发育期的小鼠胚胎发育过程中，心肌细胞和内皮细胞存在着缺氧状态。在缺氧的部位提示有HIF1α的表达且表达量呈动态表达趋势。