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非天然氨基酸因其较容易功能化的氨基及羧基基团可以附着在功能性分子上作为功能性分子的手性中心核心,并且侧链基团及长度等可以变化,已成为现代药物化学分子的基础构成模块。L-2-氨基丁酸（L-2-ABA）是合成几种重要药物的关键手性中间体原料,其化学法制备工艺复杂且易造成环境污染,而酶法主要是以L-苏氨酸脱氨酶（EC 4.3.1.19,TD）、L-亮氨酸脱氢酶（EC 1.4.1.9,LeuDH）及提供NADH再生用酶的多酶催化体系制备L-2-ABA的工艺。酶法制备工艺存在需要外源添加昂贵辅因子、培养多个细胞使成本增加的问题,并且还存在关键酶的稳定性不佳、辅因子NADH再生用酶的效率较低、多酶催化转化速率协同性差等问题,而不利于工业化生产。因此改造TD及LeuDH关键酶使其具有更高的催化活性和稳定性,进一步挖掘有工业价值的辅因子再生系统,构建更加协调稳定的多酶催化体系单细胞,能有效解决微生物法制备L-2-ABA过程中的问题。（1）TD酶作为转化L-苏氨酸到2-酮丁酸的关键酶,会受L-Ile别构抑制并且稳定性也较差,通过对TD酶的调控结构域进行合理地设计可以完全解除了L-Ile的别构抑制并显示出更好的热稳定性。通过分子动力学模拟（MD）分析,截断了来源于大肠杆菌TD的C端调控结构域的Glu480-Gly514肽段并获得完全不受L-Ile别构抑制的活性聚集体Δ11,Δ25和Δ35。与野生型相比,Δ25在2mM L-Ile存在下显示出高3.3倍的2-酮丁酸产量,在55 ℃下的产量更是高约9倍。利用傅立叶变换衰减全反射红外光谱（ATR-FTIR）方法及MD模拟分析发现活性聚集体保持类似于野生型TD的二级结构组成以及类似的三级结构。等温滴定微量热法（ITC）实验验证了活性聚集体不再与异亮氨酸存在结合能,说明酶聚集体是通过形成致密结构来解除L-Ile对酶的别构抑制。同时研究酶聚集体的固定化,发现Fe3O4纳米粒子可以非特异性吸附到聚集体上,最佳的负载pH是7,酶的载量能达到1.35±0.07 mg/mg Fe3O4纳米材料,并通过离子强度、温和溶剂及表面活性剂对酶固定化的影响推测材料与酶聚集体间主要相互作用力是氢键和离子交换相互作用力。包覆后的活性聚集体制备2-酮丁酸时在20次循环使用之后转化速率为首次转化的72%,而未固定化的活性聚集体在20次循环之后转化速率仅为首次转化的31%,说明固定化有效提高了酶的重复使用效率。（2）作为催化α-酮酸到α-氨基酸的关键用酶,LeuDH存在非天然底物亲和性及稳定性不佳的问题,因此基于BcLeuDH与其他氨基酸脱氢酶之间的结构比对,理性改造了酶的底物进出通道,获得更高催化效率及稳定性的突变株。通过改善底物进出通道疏水性及增加底物通道及结合区域的b5折叠结构的稳定性,获得了具有更高催化效率及稳定性的T45M/E116V突变株,其Tm和60°C下t1/2分别是62.8 ℃和29.2 h,远高于野生型的48.4 ℃和3.4 h。将其偶联甲酸脱氢酶（EC 1.17.1.9,FDH）后,对于非天然α-氨基酸的制备效率明显提高。另外,对D117进行饱和突变并结合分子对接模型分析推测D117在LeuDH催化α-酮酸的氨化还原过程中参与了质子转移的重要作用。（3）针对现有NADH再生用酶效率较低等问题,筛选10余种NADH再生用酶,拓展醇脱氢酶（EC 1.1.1.1,ADH）及甘油脱氢酶（EC 1.1.1.6,GlyDH）用于L-2-ABA的酶法及全细胞法制备。将葡萄糖脱氢酶（EC 1.1.1.118,GDH）、FDH、ADH及GlyDH结合TD及LeuDH酶用于L-2-ABA的酶法及全细胞法制备,其中全细胞法不添加辅因子NAD（H）,发现GDH效果最好,在以酶法及全细胞法制备L-2-ABA产量分别为102±4.7和141.6±7.2 g/L。而GlyDH虽然酶的活力较FDH及ADH的高,但副产物二羟基丙酮与产物L-2-ABA会发生美拉德反应抑制反应的进行,因此产量远低于FDH或ADH的100 g/L。此外,筛选了不同来源的L-乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27,LDH）,通过晶体结构比对结果发现酶与底物结合区域结构松散的Pf LDH对于丙酮酸及2-酮丁酸的催化活力最高,并结合ADH用于（S）-2-羟基丁酸的制备,20 h时产量达到146 g/L,转化率高达98.2±0.6%。（4）多酶催化反应过程中存在催化反应过程协调性差、易造成中间产物积累等问题,通过调控TD酶的RBS序列强度对其表达量进行了优化,构建了可调的多酶协同表达系统单细胞用于L-2-ABA的高效制备。通过调控RBS序列强度协调了多酶催化体系中每个步骤的反应速率,即TD酶及BcLeuDH偶联FDH酶体系的转化速率,发现E.coli BL21/pETDuet-R40重组菌是较适合高效转化制备L-2-ABA的菌株,在5 L发酵罐中该单细胞可实现22 h时L-2-ABA的产量为186.6 g/L,对于底物L-Thr的转化率达到100%,L-2-ABA摩尔产率98%。全细胞进行多批次转化时,发现胞内NAD+浓度需要满足一定的阈值水平才能维持转化的高效进行。最终实现了20吨发酵罐的L-2-ABA高效制备,以磷酸盐缓冲液为溶剂时产量稳定在145 g/L以上,转化速率稳定在8.0 g/（L h）,底物L-Thr摩尔产率稳定在95%。