2020年的诺贝尔化学奖授予了法国科学家埃曼纽尔·卡彭蒂耶和美国科学家詹妮弗·杜德纳,以表彰她们开发出一种名为CRISPR/Cas9的基因组编辑技术。这项技术首次让人们能够高效率地编辑基因序列,更直观地去研究基因的功能,在生命科学研究的各个层面展现出革命性的推动力。但是,准确性和安全性是目前限制该系统在活体内应用的最主要问题。本研究选择转染剂量可控、半衰期短的Cas9核糖核蛋白复合体（RNP）进行基因组编辑研究,以期开发出能够精准编辑细胞基因组的新方法和新技术。本课题首先开发了一种生产成本低、生物相容性好的纳米颗粒递送材料,能够将Cas9 RNP和DNA修复供体同时高效地递送进细胞,实现同源定向修复（HDR）介导的精准修复。采用实验室开发的“生物自组装方法”,我们制备了N端含有谷氨酸多肽（Etag）标签的Etag-Cas9 RNP。该RNP富含负电荷,能够与壳聚糖包裹的红色荧光蛋白以及单链DNA（ss DNA）修复模板通过静电相互作用自组装成200 nm左右的纳米颗粒。该方法实现了77.6%的递送效率和12.5%的HDR介导基因组编辑效率,同时在多种细胞系中产生了有效的基因组编辑。相较传统的脂质体递送方法,该方法不仅具有相当的递送效率和编辑效率,而且制备方法简便、生物相容性好,具有广泛的应用前景。研究表明,在自然条件下由基因编辑产生的双链断裂（DSBs）绝大部分经非同源末端修复（NHEJ）途径得以修复。但该过程常在基因组上删除或者插入部分碱基,造成不可控的修复结果。与之相反,能够产生精准修复的同源定向修复（HDR）途径的效率往往很低。本研究针对Cas9 RNP进行分子设计和优化,在g RNA的3′端引入可抑制NHEJ途径关键因子Ligase 4基因的sh RNA碱基序列;将Cas9基因编辑技术和RNAi干扰技术相融合,构建出Cas-RNAi RNP以提高HDR效率。目前,验证细胞基因组HDR效果的实验仍在重复和优化中。总之,本研究的成果将为实现Cas9 RNP在基因治疗领域的大规模应用提供理论指导和技术基础。