前言: 儿童喉乳头状瘤(Juvenile Laryngeal Papilloma， JLP)是广泛散在性分布于上呼吸道的良性上皮增生性瘤样病变，具有高度的复发性、侵袭性和自限性的发病特点。其临床特征以声音嘶哑及呼吸困难为主，因常引起患儿气道阻塞而成为一种潜在性的致命因素，目前仍是耳鼻喉科医生未解决的难题。1923年Ullman首先提出乳头状瘤的病毒病因学说，人类乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)于1949年由Strauss在电镜下发现。随着分子生物学和分子流行病学的迅速发展，HPV6，11型与JLP的病因学关系也日益明了。我们通过对37例JLP临床资料的回顾性分析，结合对其免疫组织化学和HPV6b/11型核酸原位杂交的检测，探讨儿童喉乳头状瘤(JLP)的临床转归与HPV不同表达的相互关系，有助于临床医生完整地了解HPV6b在JLP发生、发展过程中的作用，深入了解该疾病的病变特征，以期寻求更有效的分子生物学检测方法对JLP的发展和预后进行评估。 目的: 探讨儿童喉乳头状瘤(juvenile laryngeal papillo-matosis，JLP)组织中HPV的不同表达在判断其临床转归中的意义，以寻求更有效的分子生物学检测方法对JLP的预后进行评估。 方法： 1、标本来源：选自2001年1月至2006年5月间上海眼耳鼻喉科医院收治并经手术治疗的JLP存档石蜡包埋组织块37例，均经病理证实且有完整的病史资料；另取10例小儿声带息肉及10例正常小儿喉部组织作对照。 2、实验切片：复查所选标本的HE切片，JLP的HE染色特点是：大空泡状细胞，核嗜碱性，核周有一透明晕包绕。所有手术组织标本须经固定、脱水、浸腊和包埋，切片4um。 第一部分免疫组织化学检测(Envision法)。 [1]、试剂：使用的一抗HPV兔抗牛抗体(BPV-1，多克隆)及二抗Envision试剂盒及均购自美国的DAKO公司，工作浓度为1：100，封闭试剂0.3％PBS+0.2％Triton由华美生物工程提供。 [2]、实验步骤：常规脱蜡水化，滴加过氧化物酶阻断剂(3％过氧化氢)于组织上，直接加用一抗HPV兔抗100ul于组织上过夜，滴加二抗A液(ChemMatetmEnvision+/HRP/DAB)50ul，室温孵育30 min，滴加显色剂DAB工作液50ul，苏木精复染，封片胶封片。 [3]、结果判定：HPV-Ag染色阳性细胞表现为核内出现棕色或棕黄色颗粒沉着，PBS代替一抗作阴性对照。 [4]、图像分析及统计： ①HPV-Ag染色阳性率采用CMIAS真彩色图像分析系统测定，着色细胞(凹空细胞)占计数细胞百分率<30％为弱阳性(+)，30％～70％为阳性(++)，>70％为强阳性(+++)。 ②统计学方法：组间比较采用方差分析、t检验及相关回归进行。 第二部分核酸原位杂交法。 [1]、试剂：地高辛(Digitalin，Dig)标记的寡核苷酸探针序列：HPV6b为5TCT TAC TGT TTG GTA TAC AAT AAC ATA AAA 3，HPVll为5CCT TAG TATATT ATG CAC AAT ACC CAC AAA 3，由上海生工生物工程公司合成，地高辛检测(Anti-Digoxigeni-AP)试剂盒由德国罗氏公司提供。 [2]、实验步骤：石蜡切片粘贴于玻片上，60℃烤箱过夜，常规脱蜡，2×SSC/DEPC平衡15 min(室温)，在组织未干前加HPV6b或HPVll探针混合液20ul/张切片进行预杂交，置42℃恒温水箱中过夜，杂交后洗涤，滴加封闭液20ul片，37℃30 min，滴加生物素化兔抗地高(Anti-Digoxigenin-AP)，20ul/片，37℃60 min，BCIP/NBT显色，核固红短时复染，中性树胶封片。 [3]、结果判定：HPV感染阳性细胞表现为核内显示紫蓝色颗粒沉着。 [4]、图像分析及统计： ①HPV-DNA及其含量检测采用计算机彩色病理图像分析系统(美国IPP图像分析软件)，测定其透光度，即灰度值(A值)，并以平均值作为HPV6b和HPVll的相对含量(A值越低含量越大)。 ②统计学方法：计量数据采用(-x)±s表示，组间比较采用方差分析、t检验及相关回归进行。 结果： (1)、37例JLP中HPV-Ag染色阳性率为67.3％，HPV6b-DNA、HPVll-DNA及HPV6b+11-DNA的阳性表达率分别为53.2％、45.8％和25.4％，而声带息肉和正常喉部组织中均为阴性表达，两组比较有显著统计学意义(P<0.05)。 (2)、20例HPV6b-DNA阳性的病例，平均发病年龄为2.1±0.6岁，平均治愈年龄为6.8±2.7岁，19例有复发(19/20，95％)；而17例HPVll-DNA阳性的病例平均发病年龄为3.4±1.5岁，平均治愈年龄为4.3±0.7岁，11例有复发(11/17，64.7％)，两者比较有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明感染HPV6b阳性患儿较感染HPVll阳性患儿的平均初发年龄早，复发次数增多，其治愈年龄延迟。 结论： HPV免疫组化和ISH的检测有助于判断JLP的临床转归，ISH的检测较HPV免疫组化更为敏感。HPV6b型的阳性表达程度可以作为提示JLP发展和预后的一个有意义指标。