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猪卵母细胞的体外成熟在很多生物技术中都有应用,其中包括胞质成熟、核成熟和表观成熟,影响卵母细胞成熟的因素有很多,比如体外成熟环境、体外成熟液成分、自身的新陈代谢、卵母细胞与卵丘细胞之间的交流及自身相关母源因子的调控作用。其中,猪卵母细胞脂质含量极高,脂质代谢尤其重要,而PLIN3是一种与脂滴代谢相关的蛋白质,本研究拟对猪裸卵/卵丘细胞单独培养、裸卵与卵丘细胞共培养、卵丘-卵母细胞复合体(COCs)体外培养,观察PLIN3的变化,来初步探索PLIN3对脂滴的调节机制。PGC7是一种母源因子,有报道指出PGC7与卵母细胞成熟过程中染色质的凝聚相关,也会影响表观遗传修饰,因此,通过观察成熟过程中PGC7和表观遗传修饰的变化,来初步探索PGC7是否会通过影响表观遗传修饰来调控成熟过程。1 PLIN3在猪卵母细胞成熟中的作用机制本实验对卵母细胞和卵丘细胞进行不同模式下的体外培养,结果发现在成熟过程中存在大量的脂滴和PLIN3,说明成熟过程中可能需要脂滴代谢提供能量。裸卵组比未成熟和COC组成熟的卵母细胞中的脂滴明显小很多,未成熟和COC组卵母细胞中的脂滴仅分布在胞质,核周围分布较少,而裸卵组卵母细胞中的脂滴比较均匀,在核周也存在,说明成熟过程中脂滴会发生一系列的变化并且受到卵丘细胞的影响。卵母细胞中,PLIN3蛋白紧密包围在脂滴周围,但是未成熟和COC组卵母细胞核区无脂滴分布,却有PLIN3蛋白的存在;卵丘细胞中脂滴和PLIN3未呈现明确的位置关系,说明PLIN3不仅仅存在于脂滴表面,也存在于胞质中。体外成熟液中添加的卵泡液对于各组成熟卵母细胞中PLIN3的表达无影响,各组成熟后的卵母细胞中PLIN3 mRNA和蛋白的表达显著降低(P<0.05),卵母细胞成熟后三酰甘油的含量也明显降低(P<0.05),但是成熟模式不同没有影响;卵丘细胞经体外培养后PLIN3 mRNA和蛋白的表达显著升高(P<0.05),其中单独培养组PLIN3 mRNA表达最高,说明卵母细胞和卵丘细胞中脂滴代谢模式可能不同。PLIN3的表达模式与三酰甘油含量的变化呈平行关系,所以PLIN3可能会通过影响三酰甘油的累积控制脂滴代谢,缝隙连接虽然不会影响卵母细胞成熟中PLIN3的表达,但会影响卵丘细胞中PLIN3的表达。2 母源因子PGC7对猪卵母细胞成熟中表观修饰的影响猪卵母细胞体外成熟中,随着减数分裂的进行,极体的排出,我们发现PGC7和OCT4在染色体上会出现集中表达的现象,其中第一极体上PGC7和OCT4的表达、DNA甲基化、组蛋白H3K4和H3K9的甲基化水平、组蛋白H4K12和H4K16的乙酰化水平都要比细胞核高;PGC7、OCT4、DNMT1、DNMT3b、TET1、TET2 和TET3 mRNA的表达逐渐上升。而成熟中用细胞松弛素B(CB)处理抑制第一极体的排出后,处理24h后,这些基因的mRNA水平显著降低(P<0.01),处理45h后又恢复正常水平;PGC7和OCT4在染色体上没有集中表达的现象;DNA甲基化状态基本没变,由于染色体没有分离,所以DNA甲基化水平在染色体上也就无高低之分;在染色体缩短变粗时组蛋白H3K9的二甲基化(H3K9me2)没有消失,组蛋白H4K12也没有发生去乙酰化。说明如果极体排出受到抑制,成熟受到影响,会引起PGC7和OCT4表达的异常,表观修饰(DNA甲基化和组蛋白修饰)也会发生一系列变化。如果用组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)处理后,PGC7、OCT4、DNMT1、DNMT3b、TET1、TET2和TET3 mRNA的整体表达趋势不会受到影响;卵母细胞成熟中组蛋白乙酰化的动态模式被打乱,染色体缩短变粗时组蛋白H4K12没有发生去乙酰化。在TSA处理组卵母细胞的成熟中,H3K9me2和H3K27me3—直存在,没有发生去甲基化;与对照组一样,DNA甲基化一直存在;PGC7和OCT4在染色体上也没有集中表达的现象;卵母细胞的极体排出受到抑制,成熟受到影响。说明表观修饰发生异常,也会影响PGC7和OCT4的表达,影响卵母细胞成熟。因此,PGC7和OCT4可能会与组蛋白修饰共同作用,参与卵母细胞的成熟调控。