【摘 要】
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CAR-T细胞疗法在肿瘤治疗过程中取得了显著成就,特别是在治疗血液恶性肿瘤中效果显著,但在实体瘤治疗方面,CAR-T疗效仍欠理想。4-1BB共刺激分子的引入,有效的提升了CAR-T细胞的抗肿瘤效果,但在靶向治疗实体瘤方面依然未能取得实质性突破,因此通过整合多种信号分子、协同提高CAR-T细胞效应功能逐渐成为领域内的重要突破点和研究方向之一。4-1BB作为肿瘤坏死因子受体超家族成员（TNFRSF）,
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CAR-T细胞疗法在肿瘤治疗过程中取得了显著成就,特别是在治疗血液恶性肿瘤中效果显著,但在实体瘤治疗方面,CAR-T疗效仍欠理想。4-1BB共刺激分子的引入,有效的提升了CAR-T细胞的抗肿瘤效果,但在靶向治疗实体瘤方面依然未能取得实质性突破,因此通过整合多种信号分子、协同提高CAR-T细胞效应功能逐渐成为领域内的重要突破点和研究方向之一。4-1BB作为肿瘤坏死因子受体超家族成员（TNFRSF）,通过招募TRAF1和TRAF2,激活NF-κB信号通路来促进T细胞的增殖和存活。随着研究的深入,其他TNFRSF成员及其招募的TRAF分子对T细胞的重要调节作用逐步被揭示。GITR（Glucocorticoid-Induced Tumor necrosis factor Receptor,也称TNFRSF18）,是近年来被发现的与T细胞功能调节密切相关的新型共刺激分子,其配体为膜蛋白GITRL（TNFSFL18）。GITRL/GITR结合后,可招募TRAF2、TRAF5和TRAF6分子,在T细胞的激活、分化和记忆形成过程中具有重要的调控作用。在对多种感染和肿瘤动物模型的研究中,4-1BB和GITR及其招募的不同TRAF分子在T细胞介导的抗原特异性免疫应答中被证实具有独特而又高度互补的调节作用。研究显示,4-1BB共刺激信号在CAR-T中会促进TH1细胞的分化,而GITR/GITRL信号不仅能够增强效应T细胞的存活及增殖、抑制Treg细胞的活性,还能诱导TH9细胞的分化。TH1和TH9细胞被认为是高效的抗肿瘤免疫细胞,甚至在一些实体瘤模型及临床研究中,TH9细胞相比于TH1细胞显现出更加优良的抗肿瘤效应。基于上述研究基础,我们推测在CAR分子中整合4-1BB和GITR共刺激信号,有望提高CAR-T细胞的效应功能及肿瘤治疗效果。由于GITR在激活型T细胞中表达上调,且共刺激配体可以通过“顺式”的自身激活作用和“反式”的bystander激活方式来传递共刺激信号,因而本研究在靶向CD19和PSMA的4-1BB二代CAR-T设计基础上,使CAR-T细胞共表达GITR配体GITRL,探究GITR信号对CAR-T细胞抗肿瘤效果的影响。首先我们利用分子克隆实验技术,在实验室已有靶向PSMA和CD19的4-1BB CAR-T慢病毒表达载体的基础上,经双酶切及测序验证,成功构建相应的4-1BB-GITRL CAR-T慢病毒表达载体。接着利用慢病毒三质粒包装系统,转染293T细胞,收集病毒液,经浓缩纯化之后,生产出高滴度病毒,用它来感染人的原代T细胞,成功制备出CAR阳性率较高且能稳定表达的CAR-T细胞。体外共培养实验表明,在肿瘤抗原刺激下,共表达GITRL能够增强CAR-T细胞的扩增水平,以及提高T细胞激活分子CD25和CD69的表达,降低T细胞耗竭分子PD-1和Tim3的表达。研究证实在CAR-T细胞中共表达GITRL能够促进TH9细胞的形成以及提高IL-9的分泌水平。此外我们还发现共表达GITRL能够增强CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果,促进IFN-γ和TNF-α的分泌,同时增强了CAR-T细胞的脱颗粒作用。为了进一步评估共表达GITRL对CAR-T细胞抗肿瘤效果的影响,构建了小鼠前列腺癌模型,然后用我们的CAR-T细胞进行治疗,实验结果表明共表达GITRL增强了CAR-T细胞的抗肿瘤效果。综上所述,本研究设计和制备了一种共表达GITRL的增强型CAR-T细胞,体外细胞实验表明该新型CAR-T细胞具备更强的扩增能力和抗肿瘤效果,同时减缓了CAR-T细胞的耗竭,增强了CAR-T细胞发挥功能的持续性,并在前列腺癌小鼠体内模型中得到了验证。我们的研究揭示了GITR/GITRL这一重要的共刺激信号在CAR-T技术中的应用潜力,为提高CAR-T细胞对恶性肿瘤尤其是实体瘤的治疗效果提供了新的思路,具有重要的研究和转化意义。
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