论文部分内容阅读
研究背景及意义成纤维细胞生长因子及其受体(fibroblast growth factors/fibroblast growth factor receptors, FGFs/FGFRs)是骨发育和脂肪代谢中一类重要的信号分子,FGFR2在骨骼发育中的作用尤其受到关注。成骨细胞和脂肪细胞都可以由骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)分化而来,然而目前对于FGFR2在hBMSCs的定向分化过程中发挥的作用研究甚少。FGFR2异构体FGFR2Ⅲb和FGFR2Ⅲc的选择性剪接受多聚嘧啶束结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein, PTB)调控,有文献报道PTB参与胚胎发育过程中三胚层的形成以及外胚层成腔作用,但其是否影响hBMSCs的定向分化尚无报道。此外,hBMSCs定向分化诱导液中不同浓度的地塞米松(dexamethasone, DEX)影响hBMSCs成骨与成脂标志基因的表达,但其作用是否与FGFR2的表达有相关性并不清楚。通过探讨FGFR2可能介导的与hBMSCs成骨和成脂分化相关的调控,有助于深入了解hBMSCs的定向分化机制。目的1、明确]hBMSCs成骨和成脂分化过程中FGF1、FGF2、FGF10、FGF18及其受体FGFR1、 FGFR2Ⅲb/Ⅲc、FGFR3Ⅲb/IIIc、FGFR4的动态表达和相关信号通路,探讨外源性加入FGFR2的配体FGF1后对hBMSCs分化的影响。2、明确PTB对hBMSCs成骨与成脂分化、以及分化过程中FGFR2Ⅲb/Ⅲc表达的影响,探讨PTB与hBMSCs定向分化之间的关系。3、明确不同浓度DEX对hBMSCs成骨与成脂分化标志基因、以及FGFR2Ⅲb/Ⅲc表达的影响,探讨DEX对hBMSCs定向分化的作用。方法1、取人骨髓血,采用密度梯度离心法分离hBMSCs,贴壁培养并传代纯化,取第三代细胞分别用流式细胞术检测、成骨与脂肪诱导分化并染色进行间充质干细胞鉴定。2、第三代hBMSCs体外进行成骨和成脂诱导分化,应用Real-time PCR检测诱导分化不同时间点FGFs和FGFRs mRNA表达水平,应用免疫荧光检测诱导前后细胞中FGF1、 FGF2的蛋白表达并进行细胞定位。Western blot检测成骨分化过程中pERKl/2的表达变化。3、在成骨和成脂诱导液中分别加入不同浓度外源FGF1诱导hBMSCs3天和7天,应用Real-time PCR检测成骨与成脂标志基因的表达,并用油红O染色鉴定成脂分化效果。4、采用RT PCR和Western blot检测hBMSCs成骨和成脂分化过程中PTB的表达,采用Knock down技术抑制hBMSCs中PTB基因表达,并进行成骨诱导,检测成骨标志基因ALP、RUNX2与成脂标志基因。PPARγ以及FGFR2Ⅲb/Ⅲc的表达。5、在]BMSCs常规培养基中加入不同浓度的DEX, Real-time PCR检测成骨和成脂标志基因以及FGFR2Ⅲb/Ⅲc的表达。结果1、hBMSCs的生物学特性鉴定：第三代hBMSCs表达CD90和CD105等间充质干细胞表面标志,不表达CD29和CD44等造血干细胞表面标志物。hBMSCs在体外可被诱导分化为成骨细胞与脂肪细胞,茜素红与油红O染色均为阳性,成骨与成脂相关标志基因表达上调。2、FGFs/FGFRs在BMSCs定向分化中呈现动态表达,其中FGFR2Ⅲb与FGFR2Ⅲc在hBMSCs成骨与成脂过程中表达先上升后下降；FGFR2配体FGF1能够抑制脂滴的形成以及PPARy、C/EBPa的表达(p<0.01)而促进骨桥蛋白(OPN)表达增加(p<0.05)。3、在hBMSCs成骨分化过程中,PTB表达升高；hBMSCs Knock down PTB后成骨诱导过程中成骨标志基因RUNX2和ALP (p<0.05)的表达被抑制；而成脂标志基因PPARγ表达升高(p<0.05)；并且FGFR2Ⅲb与FGFR2ⅢC表达也受到抑制(p<0.05)。4、随着培养液中DEX浓度升高,hBMSCs增殖速度降低,形成脂滴的能力增加；高浓度组hBMSCs中成脂标志基因PPARγ、C/EBPα表达较高,低浓度组成骨标志基因RUNX2和ALP表达较高。FGFR2Ⅲb和FGFR2Ⅲc在10-6mol/L浓度中表达增强,10-8mol/L浓度中表达被抑制。结论采用密度梯度离心及贴壁筛选法连续传代纯化细胞可成功分离hBMSCs;FGFs/FGFRs在hBMSCs成骨与成脂分化过程中呈现特定趋势的动态表达,FGFR2与hBMSCs分化密切相关；PTB对hBMSCs成骨分化的调节可能由FGFR2介导；不同浓度DEX能够影响hBMSCs的增殖速率和成骨、成脂分化标志基因的表达,高浓度DEX对hBMSCs定向分化的作用可能由FGFR2来介导。