目的:分别构建PDL1胞外段基因（以下简称为PDL1）和FADDdel-GFP融合基因真核表达载体，采用脂质体转染技术分别将Wee1Hu-GFP、FADDdel-GFP和PDL1导入NIT(鼠胰岛β细胞系)，体外研究基因修饰NIT抗T细胞胞毒效应;采用STZ（链脲佐菌素）腹腔注射Balb/c小鼠诱导Ⅰ型糖尿病模型，研究FADDdel-GFP基因修饰的NIT对实验性Ⅰ型糖尿病的影响，为深入研究Ⅰ型糖尿病的发病机制、移植免疫的应用研究及诱导免疫耐受提供理论基础和实验依据。　　一、Wee1Hu-GFP基因修饰NIT抗特异T细胞胞毒效应及其机制研究　　方法：采取Lipofectin将Wee1Hu-GFP基因导入NIT，利用倒置荧光相差显微镜检测其表达;体内外联合诱导制备特异性T细胞作为效应细胞，以转染Wee1Hu-GFP前后的NIT为靶细胞，在抗穿孔素抗体的作用下，采用LDH法和ELISA凋亡试剂盒检测特异性T细胞介导的胞毒效应。　　结果：Wee1Hu-GFP修饰的NIT可见绿色荧光表达;鼠脾细胞经体内外联合诱导可获得具有高杀伤活性的效应T细胞;Wee1Hu-GFP基因修饰的NIT可明显抵抗特异性T细胞介导的细胞凋亡，而穿孔素抗体可协同此抗凋亡作用;特异性T细胞溶解靶细胞效应的分析表明，穿孔素抗体可显著抑制T细胞对Wee1Hu-GFP修饰前后的NIT细胞的杀伤效应。　　二、FADDdel-GFP融合基因的构建、表达及其修饰NIT抗胞毒效应研究　　1.FADDdel-GFP融合基因真核表达载体构建及表达　　方法：采用基因工程技术扩增FADDdel(FADD缺失突变体)，将其定向连接于pEGFP-N1，构建FADDdel-GFP融合基因的真核表达载体pFADDdel-GFP，酶切和PCR鉴定;脂质体LipofectamineTM2000介导重组体转染NIT细胞，采用倒置荧光相差显微镜检测融合蛋白的表达，G418筛选后，FACS检测FADDdel-GFP的表达阳性率。转染pFADDdel-GFP的NIT记为NITf-g，转染pEGFP-N1的NIT记为NITg。　　结果：酶切重组子后得到约1235bp片段，大小与FADDdel-GFP融合基因片段相符，证明FADDdel-GFP融合基因真核表达载体构建成功;将pFADDdel-GFP转染NIT后，可见NIT胞浆中有绿色荧光表达;G418筛选获稳定表达后，流式细胞术(FCM)检测FADDdel-GFP的表达阳性率为65.88％。　　2.FADDdel-GFP融合基因修饰NIT抗特异性T细胞胞毒效应　　方法：用IFN-γ、IL-1β或IFN-γ+IL-1β处理NIT后检测其表面的Fas表达;体内外联合诱导制备特异性T细胞作为效应细胞，取细胞因子处理后的NIT、NITg、NITf-g作为靶细胞，采用FCM和MTT法检测基因修饰NIT的抗特异性T细胞的胞毒效应。　　结果：NIT表面Fas表达极低，细胞因子可促进其表面Fas的表达;FADDdel-GFP修饰的NIT(NITf-g)对特异性T细胞介导的细胞毒效应有明显抵抗。　　3.FADDdel-GFP融合基因修饰NIT抵抗Fas抗体诱导的细胞凋亡　　方法：在细胞因子处理后的NIT、NITg、NITf-g培养上清中加入Fas抗体，作用12h后检测细胞内Caspase-3活性变化;用PI染色，FCM检测Fas抗体诱导的胞毒效应。　　结果：Fas抗体作用于细胞因子处理的三组细胞后，胞内Caspase-3活性均明显增加，而转染pFADDdel-GFP的NITf-g组细胞内Caspase-3的活性明显低于其它两组细胞;PI染色结果显示，转染pFADDdel-GFP的NITf-g细胞的细胞损伤百分率明显低于NIT和NITg细胞。结果表明转染pFADDdel-GFP的NITf-g可抑制抗Fas抗体诱导的细胞凋亡。　　4.FADDdel-GFP融合基因修饰NIT抗细胞诱导凋亡效应的检测　　方法：用细胞因子处理NIT后检测其表面的FasL表达;FACS检测细胞Caspase-3的活性，同时用PI染色检测细胞诱导凋亡效应。　　结果：NIT表面FasL表达低，细胞因子可促进其表面的FasL表达;转染pFADDdel-GFP的NITf-g对细胞诱导凋亡效应有明显抵抗，表明细胞表面FasL和Fas表达增高后，可通过自杀或他杀诱导细胞凋亡。　　三、FADDdel-GFP融合基因修饰NIT在实验性Ⅰ型糖尿病中的作用　　1.FADDdel-GFP融合基因修饰的NIT胰岛素分泌测定　　方法：采用胰岛素刺激释放实验检测转基因前后NIT细胞胰岛素的分泌情况。　　结果：FADDdel-GFP融合基因修饰的NIT分泌胰岛素未受到影响。　　2.FADDdel-GFP融合基因修饰的NIT对实验性Ⅰ型糖尿病的影响　　方法：用STZ在Balb/c小鼠诱导Ⅰ型糖尿病动物模型;对造模成功的糖尿病小鼠腹腔移植FADDdel-GFP融合基因修饰的NIT，在移植后第8d和22d，对糖尿病小鼠、血糖恢复接近正常的受者和正常对照小鼠，采用放免法检测血液中胰岛素的含量，并进行糖耐量试验。　　结果：用STZ成功诱导Ⅰ型糖尿病小鼠模型;糖尿病小鼠在移植FADDdel-GFP融合基因修饰的NIT(NIT f-g)后，存活期较移植转染空载体NITg细胞和注射PBS对照组糖尿病小鼠明显延长。移植后第8d，血糖正常的受者胰岛素分泌及糖耐量试验接近正常小鼠，移植后22d，受者的胰岛素分泌明显低于正常小鼠，显示移植排斥反应发生。　　四、分泌型PD-L1基因真核表达载体的构建、表达及其体外效应的初步研究　　1.PD-L1基因真核表达载体的构建及表达　　方法：RT-PCR从孕鼠胎盘中获得程序性坏死因子-1(Programmed death-1，PD-1)配体PD-L1的胞外段基因片段，连于T载体后进行测序;引入HindⅢ和SalⅠ酶切位点，将PD-L1定向连接于pcDNA3.1上构建真核表达载体pcDNA-PDL1，进行酶切鉴定;用脂质体将重组子导入NIT细胞，转染后的NIT命名为NITp; G418筛选获得稳定转染后，细胞RT-PCR鉴定pcDNA-PDL1是否导入到细胞内，SDS-PAGE检测NITp培养上清中PDL1的表达。　　结果：RT-PCR得到约730 bp的目的基因片段，测序结果显示该目的基因与Genebank上的序列相符;转化子用HindⅢ和SalⅠ双酶切得到大小相符的片段，显示pcDNA-PDL1已构建成功;RT-PCR从NITp细胞中得到约730 bp基因片段，未转染的NIT细胞无此基因片段;SDS-PAGE分析NITp的浓缩培养上清，可见约31KD处出现条带，与PDL1胞外段理论值相符，提示NITp分泌性表达目的蛋白。　　2.PD-L1生物学活性的初步检测　　方法：取C57小鼠部分脾细胞加入丝裂霉素C处理后作为刺激细胞，未经丝裂霉素C处理的Balb/c小鼠脾细胞C作为反应细胞，MTT比色法检测NITp细胞培养上清对同种混合细胞培养反应的影响;取NIT免疫后的Balb/c小鼠脾细胞作为反应细胞，以NITp作为刺激细胞，同时加入NITp的浓缩培养上清，共培养6d，利用IL-4、IFN-γ、IL-2 ELISA试剂盒检测反应性T细胞分泌的细胞因子。　　结果：NITp培养上清可抑制混合淋巴细胞增殖，其效应呈剂量依赖性;反应性T细胞分泌的细胞因子检测结果显示，培养上清中IL-4、IFN-γ、IL-2水平降低，与正常对照组有明显差异。　　结论：本课题在研究基因修饰细胞抵抗效应细胞胞毒作用的过程中发现:①Wee1-GFP基因修饰的NIT在一定程度上可抵抗特异性T细胞介导的细胞毒作用，且此抗胞毒作用可被穿孔素抗体协同增强;②成功构建FADDdel-GFP融合基因真核表达载体，FADDdel-GFP融合基因修饰的NIT可有效抑制死亡受体介导的细胞内凋亡信号传导，以及抵抗抗Fas抗体和膜型FasL介导的细胞凋亡;并可使STZ诱导的糖尿病小鼠血糖降至较低水平，明显延长移植物的存活时间;③成功构建PD-L1基因真核表达载体pcDNA-PDL1，PD-L1蛋白对同种细胞刺激的增殖反应有抑制作用，并可在一定程度上抑制特异性T细胞的活化。